SNT 3767.20-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第20部分：水稻Bt-63品系.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 sN/T3767,20 2014 出口食品中转基因成分环介导 温扩增 (LAMP)检测方法 部分 :水 稻Bt63品 系 Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export- Part 20:Rice Bt-63 14-O13发 布 14-08-01实 施 等第 中华人民共和国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发布 sN/T3767.20-2014 亠刖 亠 一一曰 SN/T3767 出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法 共分为30部分 : 第1部分 :通 用要求和定义 ; 第2部分 :筛 选方法 ; 第3部分 :玉 米Bt11品系 ; 第4部分 :玉 米Bt176品系 ; 第 5 部 分 : 玉 米 G A 2 1 品 系; 第 6 部分 : 玉 米M I R 1 6 2 品 系 ; 第 7 部分 : 玉米M I R 6 0 4 品 系 ; 第 8 部分 : 玉 米M O N 8 1 0 品系 ; 第 9 部 分 : 玉 米 M O N 8 6 3 品 系; 第 1 0 部分 : 玉 米M O N 8 8 0 1 7 品 系 ; 第 1 1 部分 : 玉 米M O N 8 9 0 3 4 品 系 ; 第12部分 :玉 米T25品系 ; 第 1 3 部分: 玉米3 2 7 2 品 系 ; 第 1 4 部分: 玉米5 9 1 2 2 品 系 ; 第 1 5 部分 : 大豆A 2 7 0 4 1 2 品 系 ; 第 1 6 部分 : 大豆A 5 5 4 7 1 2 7 品 系 ; 第 1 7 部分 : 大豆D P 3 5 6 0 4 3 品 系 ; 第 1 8 部分 : 大豆G T 泓 2 品系 ; 第 1 9 部分 : 大豆M O N 8 9 7 8 8 品 系 ; 第部分 :水 稻Bt63品系 ; 第21部分 :水 稻KF6品系 ; 第22部分 :水 稻KF8品系 ; 第23部分 :水 稻KMD品系 ; 第 2 4 部分 : 水 稻L L R I C E 6 2 品 系 ; 第25部分 :水 稻M12品系 ; 第 2 6 部分 : 水稻T 1 G 1 9 品系 ; 第 2 7 部 分 : 水 稻 T 2 A 1 品 系; 第 2 8 部分 : 小麦B 7 3 6 1 品系 ; 第29部分 :甜 菜H71品系 ; 第30部分 :油 菜RT73品系。 本部分为SN/T3767的第部分 。 本部分按照GB/T1.109给出的规则起草。 请注意本文件的某些 内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本部分 由国家认证认可监督管理委员会提出并归 口。 本部分起草单位 :中 华人 民共和 国广东 出人境检验检疫局 、 中华人 民共和 国汕头 出人境检验检疫 局、 中国检验检疫科学研究院、 中华人 民共和国福建出人境检验检疫局 、 中华人 民共和国辽宁出人境检 I sN/T3767.20-2014 验检疫局 、 中华人 民共和国珠海出人境检验检疫局 、 中华人 民共和国北京 出人境检验检疫局 、 中华人 民 共和国上海出人境检验检疫局 、 仲恺农业工程学院、 广州迪澳生物科技有限公司。 本部分主要起草人 :易 敏英 、 凌莉 、 卓锦雪 、 蔡颖 、 刘静宇、 谢力 、 陈颖 、 邵碧英 、 曹际娟 、 冯家望 、 曾静 、 李晓虹 、 高苏娟 、 石磊 、 张隽 、 陈源树 、 李婷 t关 丽军 、 李志勇 。 出口食品中转基因成分环介导 等温扩增(AMP)检 测方法 第 部分 :水 稻 Bt-63品 系 1 范 围 S N / T 3 7 6 7 的 本 部分 规 定 了稻 谷 和大米 中转基 因水 稻B t 6 3 (LAMP)初 筛检测方法 。 本部分适用于稻谷和大米 中 本方法的定性检测低限为0。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是日期的引用文件 ,仅 注 日期的版本适用于本文 件 。凡是不注 日期的引用文件 , 本文件 。 GB/T6682 分 析实验室用 GB/T19495.2 转 基 因 产 品 GB/T19495.3 转 基 因 产 品 G B / T 1 9 4 9 5 . 7 转 基 因 产 品 检 测样和制 sN/T2584 水 稻及其产品中分法 SN/T3767.2 2o14 出 口 因 LAMP)检 测方法第 2部 分 :筛 选方法 3 防污染措施 环介导等温扩增检测过程 4 抽样与制样 按照 GB/T19495.7的 规定执行 。 5 核酸提取纯化 按照 G B / T 1 9 4 9 5 . 3 的 规定 执行。 6 LAMP检 测方法 6.1 原 理 6.1.1 一 般原理 根 据转基 因水 稻Bt-63品系外 源基 因和水 稻边早序列设 计 特异性 内引物和外 引物各 一对 ,特 异性 - 1 sN/T3767.20-2o14 品系特异性 的环介导等温扩增 检测。 sN/T3767.20-2014 目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别 目标序列上的六个独立 区域 ,利 用Bs莎酶启动 循环链置换反应 ,在 水稻Bt63品系特异 目标序列启动互补链合成 ,在 同一链上互补序列周而复始形成 有很多环的花椰莱结构的茎-环DNA混合物 ;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液 中的Mg2+结 合 ,产 生副产物(焦 磷酸镁)形 成乳 白色沉淀 ,加 人显色液 ,即 可通过颜色变化观察判定结果 。 6.1.2 显色液显色原理 SYBR Green I是 一种高灵敏的DNA荧 光染料 ,可 以嵌人方式结合到双链DNA的 小沟 内。当它 与双链DNA结合时,荧 光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时 ,SYBR染料分子的 荧光信号不发生改变 ,颜 色显现为橙色 ;当 发生扩增反应时 ,随 着双链DNA的增加 ,SYBR染料 的荧光 信号也随之大幅度增强 ,其 信号强度可代表双链DNA分 子的数量 ,同 时颜色 由橙色变为绿色 。 6.2 仪器和设备 6.2.1 超纯水发生器 。 6 . 2 , 2 水 浴锅或加热模板 : 6 3 。0 0 . 5 和 8 0 。 0 0 , 5 。 6.2.3离心 管 :0.1mL、 1.5mL。 6 . 2 . 4 移 液 器: 量程 0 . 5 u L 1 0 u L ; 量 程 1 0 u L 1 0 0 u L ; 量 程 1 0 0 u L 1 0 0 0 u L 。 6.2.5 计时器 。 6.3 试剂和材料 除另有规定外 ,所 有试剂均为分析纯或生化试剂 。 、 6.3,1 实验用水 :应 符合GB/T6682中 一级水的规格 。 6 . 3 . 2 d N T P s 溶液: 每 种核苷酸 浓 度 1 0 m m o l / L 。 6.3.3 B耐DNA聚合酶(如 :NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶 浓度8U/uL。 6 . 3 . 4 1 0 T h e r m o l P o l 缓冲液: 含 0 m m o l / L T s H C l ( p H 值为 8 . 8 ) 、1 0 0 m m o l / L 硫酸铵、 100mmol/L氯 化钾、 mmol/L硫 酸镁、1%T。 ton 100。 6.3.5 硫 酸镁溶液 :150mmol/L。 6.3.6 甜菜碱:5m。l/L。 6,3.7 显 色液:SYBR Green I荧光 染料 ,1000。 6.3.8 引物 :根 据转基因水稻Bt63品系外源基 因和水稻边界序列设计一套特异性引物 ,包 括外引物 1,外 引物2,内引物1和内引物2。 外引物扩增片段长度 :9bp 夕 卜 引 物 1(F3,5 -3 ):TCTTGCCCGGCGTCAAT 夕 卜 引 牛 勿2(B3,5 -3 ):TTCGTAGCCCCACCACTAC 内 引 物 1(FIP,5 -3 ):TTGACTGGAGCGAGGCGATGGGATAATACCGCGCCACAT 内 引 4勿2(BIP,5 -3 ):GACCGCTGTTATGCGGCCATTCCTCTAGAGTCGACCTGC 6.4 检测步骤 6,4.1 阴性对照、 阳性对照和空白对照的设置 6.4.1.1 阴性对照 : 采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板 。 6.4.1.2 阳性对照 : 采用含有 目标基因序列的植物DNA或质粒DNA作为模板 ,浓 度应略高于方法检测低限。 2 丨 | I sN/T3767.20-2014 6,4.1.3 设 两个空 白对照 : 提取 DNA时设置的提取空 白对照(以 水代替样品); TLAMP反 应的空 白对照(以 DNA溶解液代替DNA模 板)。 6.4.2 内 源基因检测 LAMP检 测前应先进行 内源基因检测 ,结 果 阳性则表明从样 品中提取 的DNA可以进行外源基 因 检测 ;否 则应重新进行DNA提取和纯化 。内源基因的检测参照SN/T3767,2 14的 规定进行 。 6.4.3 水 稻B 63品 系LAMP反应体 系 LAMP反 应体系见表1。每个样 品各做2个平行管 。加样时应使样 品DNA溶液完全加人反应液 中,不 要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后 ,将1uL显色液滴在管盖 内侧 ,盖 管盖时应小心 ,防 止 显色液混合进人反应液 中。 表1 水稻B 63品 系LAMP反应体系 6. LAMP反 应参数 6 3 . 0 o . 5 恒温扩增 9 0 m h , 8 0 . 0 o . 5 5 m i n 使 酶灭活, 反 应结束。 6.4.5 显 色反应 反应结束后 ,将 显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀 ,立 即在黑色背景下进行颜色观察 。 6.5 质 量控制 6.5.1 基 本原则 :实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况 。否则 ,任 一种对照如果 出现非下述正常结果 ,应 重做实验 。 6.5.2 空 白对照 :反 应管中液体呈橙色。 6.5.3 阴 性对照 :反 应管 中液体呈橙色。 组 分 工作液浓度力 口 样量/fiL 反应体系终浓度 ThermolPol缓 冲液 1 夕 卜 狈 刂 L游弓 H勿 (F3)10umol/L 0.2uml/L 夕 卜 狈 刂 下游弓 H勿 (B3)10umol/L 0 , 2 u m o l / L 内侧上游引物(FIP)40 pmol/L1,0 1,6umol/L 内侧下游引物(BIP)40uml/L 1.o1,6um1/L dNTPs10mmol/L1.6mmol/L 甜菜碱5md/Lo,8mol/L 硫酸镁 150mmol/L1 6mm l/L Bs莎DNA聚合酶8U/uL1 o,32U/uL DNA模板100 nglpl- 8 ne/ pL 水补足至 25,0 sN/T3767.20-2014 6.5.4 阳 性对照 :反 应管中液体呈绿色。 7 结果判断和确证 7.1 待 检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色 ,同 时各种实验对照结果正常 ,可 判断该样 品检测结 果为阴性。 7.2 待 检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈绿色 ,同 时各种实验对照结果正常 ,可 判断该样 品 转基因水稻Bt-63品系初筛阳性 还应通过下列方法之一进行确证(见附录A): 按照 S N / T 2 5 8 4 进 行实时荧光 P C R 检 测; 可对外引物 PCR扩增产 8 结果表述 8.1 检 测结果为阴性 ,表 述为“该样品未检出转 8.2 检 测结果为转基因水稻Bt-63品系初实验情况进行结果判断和表述 。 sN/T3767.20 2014 附 录 A (资 料性 附录) 转基 因水稻Bt-63品系基 因序 列 A , 1 转 基因水稻B t - 6 3 品系 特异目标序列( 来自A c c e s s i o n n o 。 H Q 1 6 1 0 5 5 . 1 ) 1669TCTTGCCCGGcG 1681TCAACGGG AD ATACCGcGCCACATAGC AGAAcTTTAA CccCcGAAcA TcGccTCGCT 1741CC冫GTC y G ACTGG TGATG GC 1801GGCCj、TGCCTGG0GTCGA G躬 屺 GGGT 1861AGTGGTGGGG cTAcGAA A,2 引 物 碱 基 序 列及 构 成 F3:TCTTGCCCGGCGTcAAT B3:TTCGTAGCCccACCAcTAC TTGACTGGAGCGAGGCG B1c BIP: GACCGcTGTTATGcGGCC 寸冖0 丨卜z 中华人民共和国出人境检验检疫 行 业 标 准 出口 食品中转基因成分环介导 等温扩增(LAMP)检测方法 第部分 :水 稻B 63品 系 SN/T3767,20-2014 中 国