利用各组分在固定相和流动.ppt

色谱法,第六章,色谱法 利用各组分在固定相和流动 相之间分配系数的差异得到 分离，再逐个进行分析,是分离、分析同时进行的一类分析方法,高效液相色谱法（HPLC）,气相色谱法（GC）,薄层色谱法（TLC）,常用的色谱法,1. 分配系数（K） 各组分在固定相和流动相之间 达到平衡时的浓度之比,2. 容量因子（k） （质量分配系数） 各组分在固定相和流动相之间 达到平衡时的质量之比,k,kAkB 是分离的先决条件,容量因子（k） （质量分配系数） 不仅与被测组分、固定相、流动 相及温度有关，还与两相体积有关。 容量因子比分配系数更易测定。,3. 色谱过程方程 保留时间与分配系数的关系,第一节 薄层色谱法,薄层色谱法（TLC法） 将固定相涂布在玻璃、塑料或金 属板上形成薄层，在此薄层上进行色 谱分离的方法,简便、快速、灵敏、高选择性、显色方便,1. 吸附薄层色谱的分离原理 点在薄层板上的样品不断 地被吸附剂吸附和被展开剂溶解 而解吸，并随展开剂向前移动， 从而产生差速迁移得到分离,一、基本原理,2. 比移值,Rf 最佳范围 0. 3 0. 5 可用范围 0. 2 0. 8,3. 分离度（分辨率）（R） 薄层板上 两相邻斑点中心距离与 两斑点平均宽度的比值,色谱图上 两色谱峰顶尖距离与两 色谱峰的峰宽和之比,二、操作方法,1. 吸附剂,活化 105110加热30,硅胶活性强弱与含水量有关，水 分越高活性越低，吸附力越小,硅胶H、硅胶HF254 硅胶G、硅胶GF254,（一）吸附剂和展开剂的选择,（1）硅胶,2. 氧化铝 酸性、中性和碱性,活性与含水量有关,3. 聚酰胺 表面有酰胺基，可与酚、羧 酸、氨基酸等形成氢键,2. 展开剂,极性较强组分 活性低的薄层板 极性较强的展开剂 极性较弱组分 活性高的薄层板 极性较弱的展开剂,（二）薄层板的制备,（三）点样与展开,（四）斑点的定位,普通板 日光下（直接或显色） 紫外灯下（荧光） 荧光板 荧光淬灭,三、应用,（一）鉴别 对照品法 比较供试品与对照品的Rf值 及颜色是否一致,（二）检查,供试品供试品溶液,杂质对照品对照品溶液,1. 杂质对照品法,优点：同一物质，同一Rf值比较， 准确度高、直观性强,缺点：需要杂质对照品,2、高低浓度对比法 以供试品溶液的稀溶液作为对照液,A、供试品所显杂质斑点与对照液 主斑点比较，不得更深 B、规定供试品杂质斑点的个数,缺点：不同物质，不同Rf值的比较， 准确度差、直观性差,优点：以供试品的稀溶液作为对照液， 不需要杂质对照品，简单、价 廉，还可配成几种限量的对照 溶液,01：79. 以硅胶为固定相的薄层色谱 按作用机制属于 A. 吸附色谱 B. 离子交换色谱 C. 胶束色谱 D. 分子排阻色谱 E. 亲合色谱,例1、TLC法中，各分离组分的Rf值 最佳范围是 A、 0.20.8 B、 0.30.5 C、 0.30.8 D、 0.50.8 E、 0.20.3,第二节 气相色谱法和高效液相色谱法,一、气相色谱法（GC法） 以气体为流动相的色谱法,（一）基本原理 各组分在固定相与载气之间由 于分配系数不同而按不同顺序被带 出，分配系数小的组分先流出，分 配系数大的后流出,优点 灵敏度高、样品用量少 分离效能高，分离速度快,缺点 受样品蒸气压的限制 不适于难气化和热稳定性差 的药物,1. 基本概念,峰高 峰面积 峰位（保留值）用于定性 峰宽 用于衡量柱效,保留值 可用时间或体积表示,（1）保留时间（tR）,（2）死时间（t0）,（3）调整保留时间（tR）,色谱区域宽度,（1）标准差（） 0.607h的W/2,（2）半峰宽（Wh/2）,（3）峰宽（W）,2. 塔板理论,基本假设 色谱柱中有无数塔板， 样品在每个塔板内的 气、液两相进行分配,理论塔板数,塔板数越多，塔板高度越小，柱效越高,3. 速率理论 Van Deemter方程,塔板高度,涡流扩散,纵向扩散,载气速度,传质阻抗,（二）气相色谱法分类,填充柱色谱法（粗） 毛细管柱色谱法（细）,气 固色谱法（吸附柱） 气 液色谱法（分配柱）,（三）常用固定液与载体,1. 固定液 鲨鱼烷、SE-30、OV-17、 聚乙二醇,2. 载体 硅藻土型载体（红色、白色）,3. 毛细管色谱柱 开管型毛细管柱（WCOT、SCOT） 填充型毛细管柱,（四）气相色谱仪 气源 进样及气化系统 色谱柱和柱温箱 检测器 热导检测器 氢火焰离子化检测器 电子捕获检测器,ChP（2000）对气相色谱仪的一般要求 色谱柱 填充柱或毛细管柱（空心柱) 固定液 高沸点液体 载气 氮气 检测器 氢火焰离子化检测器（FID） 检测温度高于柱温 一般 250 350,96：128、在气相色谱法中，与含量成 正比的是色谱峰的 A、保留体积 B、保留时间 C、相对保留值 D、峰高 E、峰面积,00：75. 在色谱分离中，组分达到平衡时， 在固定相中的质量为Ws，浓度为Cs，在 流动相中的质量为Wm，浓度为Cm，则 此组分的容量因子为 A、Cs/Cm B、Cm/Ws C、Ws/Wm D、Wm/Ws E、WsCs/WmCm,例1、气相色谱法可测定的药物为 A、沸点低于450 B、沸点低于550 C、沸点在450以上 D、无机药物 E、热不稳定药物,例2、气相色谱仪组成部分应有 A、气路系统 B、进样系统 C、分离系统 D、检测系统 E、记录系统,二、高效液相色谱法（HPLC法） 以液体为流动相的色谱法,（一）HPLC的速率理论,与气相色谱法的差别 GC法 高温（ChP 50 265） 纵向扩散项大（B/u） HPLC法 室温 传质阻抗项大（Cu）,1. 液-固吸附色谱法 固定相 常用硅胶 流动相 烷烃+极性调整剂,（二）各类HPLC法,2. 液-液分配色谱法 固定相 目前大多是用化学方法将 固定液键合在载体（硅胶）上所形 成，即化学键合相,（1）正相色谱法 流动相极性固定相极性 分析亲脂性的极性及中等极 性的分子型药物 极性弱的组分先流出色谱柱,（2）反相色谱法（RP-HPLC） 流动相极性固定相极性 分析非极性、中等极性药物 极性强的组分先流出色谱柱 固定相 ODS（C18） 辛烷基（C8） 流动相 甲醇-水，乙腈-水,（3）反相离子对色谱法（PIC） 如样品在极性流动相中可解离 为离子，若将离子对试剂加入流动 相， 与被分析离子生成中性离子， 即可增大样品在非极性固定相中的 溶解度,（4）离子抑制色谱法（ISC） 测定弱酸、弱碱类药物时，通 过调整流动相pH值，抑制样品的解 离，以增大样品在非极性固定相中 的溶解度 适用于弱酸（3.0pKa7.0） 弱碱（7.0pKb8.0）,（三）常用固定相,1. 硅胶 用于吸附色谱,2. 化学键合相 非极性 ODS（十八烷基键合相） 极性 氨基、氰基键合相,3. 键合型离子交换剂,（四）高效液相色谱仪 高压输液泵 色谱柱 柱管+固定相 进样阀 六通阀（有定量环） 检测器 紫外吸收检测器 荧光检测器 差示折光检测器 电化学检测器,中国药典规定 正文各品种项下的HPLC条件,不得任意改变 固定相种类、 流动相组分、检测器类型,可适当改变 色谱柱内径、长度、 固定相牌号、载体粒度、流动相流速 和比例、柱温、进样量、灵敏度,三、系统适用性试验 ChP 每次检测前，应对仪器进 适用性试验，应达到规定要求 理论板数（n） 分离度（R） 重复性（RSD） 拖尾因子（T）,（一）理论板数（n） 如测得n低于规定，应改变柱长 或载体性能、重填色谱柱等以求达到,（二）分离度（R） 除另有规定外，R1.5,（三）重复性（RSD） 15 33,（四）拖尾因子（T） 除另有规定外，T应0.95 1.05,四、GC和HPLC在药品检验中的应用 1. 鉴别 在相同的色谱条件下，分别取 供试品溶液和对照品溶液进样，记 录色谱图，供试品溶液主峰的保留 时间应与对照品溶液一致,2. 杂质检查 内标法（加校正因子） 外标法 主成分自身对照法（加校正因子） 主成分自身对照法（无校正因子） 面积归一化法,（1）内标法 + 校正因子,内标+杂质对照品计算校正因子,内标+样品计算杂质含量,优点 准确,内标物+ 杂质对照品 校正因子,内标物+样品 杂质含量,（2）外标法,供试品供试品溶液,杂质对照品对照品溶液,缺点 不易控制进样量 宜用定量环,（3）加校正因子的主成分自身对照法,待测成份对照品+杂质对照品 计算校正因子,供试品供试品溶液,供试品的稀释液对照品溶液,测量供试品溶液色谱图上各杂质 的峰面积，分别乘以相应的校正因子 后与对照溶液主成分的峰面积比较， 依法计算各杂质含量,优点 准确度高,（4）不加校正因子主成分自身对照法,供试品供试品溶液,供试品的稀释液对照品溶液,测定供试品溶液中各杂质峰面积， 与对照溶液主成分峰面积比较，控制 杂质的量,缺点 检测波长处，各杂质和药物的 吸收强度可能有差异，准确度 差,优点 不需杂质对照品，可同时控制 各个杂质及其总量限度,（5）面积归一化法,取一定量供试品溶液进样，测定各杂质的峰面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各杂质峰面积占总峰面积的百分率，应符合规定。,优点 不需杂质对照品，简便易行,缺点 检测波长处，各杂质和药物 的吸收强度可能有差异，控制 杂质峰面积百分率不一定就是 杂质限量，准确度差,3. 在含量测定中的应用,（1）外标法,（2）内标法,96：75、测得两色谱峰的保留时间 tR1=6.5min，tR2=8.3min，峰宽 W1=1.0min，W2=1.4min，则两 峰分离度R为 A、0.22 B、1.2 C、2.5 D、0.75 E、1.5,99：135、HPLC法与GC法用于药物 复方制剂的分析时，其系统适用 性试验系指 A、测定拖尾因子 B、测定回收率 C、测定保留体积 D、测定分离度 E、测定柱的理论板数,99m:91-95相关方法为 A、紫外分光光度法 B、红外分光光度法 C、气相色谱法 D、高效液相色谱法 E、荧光分光光度法 91、由第一电子激发态的最低能级跃迁回基态的 各个不同振动能级 92、低能级的价电子吸收一定的能量后，跃迁到 较高能级 93、使用氢火焰离子化检测器 94、分子中振动和转动能级的跃迁 95、可以忽略流动相中的纵向扩散项,E,A,C,B,D,00：132、中国药典（2000年版）规定 系统适用性试验应包括 A、色谱柱的理论塔板数 B、分离度 C、重复性 D、中间精密度 E、拖尾因子,00：133. 中国药典（2000年版）正文各 品种项下规定的HPLC条件中， 不得任意改变的是 A. 固定相种类 B. 固定相牌号 C. 流动相组成 D. 混合流动相各组分的比例 E. 检测器类型,01：80. 用HPLC测得两组分的保留时间 分别为8.0和10.0min，峰宽分别为2.8和 3.2mm，记录纸速为5.0mm/min，则两 峰的分离度为 A. 3.4 B. 3.3 C. 4.0 D. 0.7 E. 6.8,01：121-125以下情况所适用的方法 A. 高效液相色谱法 B. 气相色谱法 C. 两者均可 D. 两者均不可 121. 可用于测定药物的含量 122. 以气体为流动相 123. 以液体为流动相 124. 使用氢火焰离子化检测器 125. 不适用于热不稳定化合物的分析,C,B,A,B,B,01：140. 色谱系统适用性试验的项目有 A、拖尾因子 B、理论板数 C、检测限 D、定量限 E、分离度,例1、色谱法定量测定的方法有 A、面积归一化法 B、主成分自身对照法 C、内标法 D、外标法 E、反相法,例2、色谱系统适用性试验一般包括 A、测试色谱柱理论塔板数（n） B、测量峰高 C、测试分离度（R） D、测试拖尾因子（T） E、测定保留体积,例3、色谱系统适用性试验要求分离度 A、应大于1.5 B、应小于1.5 C、应大于2.5 D、应小于2.5 E、应大于3.0,例4、中国药典（2000年版）规定，除 另有规定外，色谱系统适用性试 验中的拖尾因子（T）应在 A、0.506.5 B、6.57.5 C、7.508.50 D、8.509.50 E、0.951.05,例5、色谱法鉴别被分离物各组分时， 应该用 A、峰高 B、峰宽 C、保留值 D、分配系数 E、塔板数,例6、衡量色谱系统好坏的参数是 A、分散度 B、Rf 值 C、分离度 D、保留时间 E、斑点面积,例7、衡量色谱峰是否正常的参数应是 A、校正因子 B、峰宽 C、峰高 D、拖尾因子 E、拖尾峰,例8、RP-HPLC固定相与流动相极性 关系是 A、两者极性相同 B、前者极性大于后者 C、后者极性大于前者 D、两者是同一液体 E、两者均为惰性,例9、色谱峰高（或面积）可用于 A、鉴别 B、计算保留值 C、含量测定 D、测试被分离物的疗效 E、判定被分离物组成,例10. HPLC检查药物中杂质的方法有 A面积归一化法 B加校正因子的主成分自身对照法 C不加校正因子的主成分自身对照法 D外标法 E内标法加校正因子测定法,例1115 A、Vis B、IR C、UV