实验-8-原生质体游离与体细胞融合.ppt

植物组织培养实验技术,北京林业大学 2015-5,实验八 原生质体游离与体细胞融合,一 实验目的,通过观察落从叶肉分离出的原生质体，了解植物原生质体分离和体细胞杂交的基本方法。,二 实验内容,原生质体的分离 原生质体来源：叶片、愈伤、细胞悬浮培养物 分离原生质体：机械法、酶解法 影响因子：前处理、酶处理、渗透压 原生质体净化：过滤、沉降法、漂浮法、界面法,2. 原生质体的融合 自发融合 诱导融合： NaNO3处理 高pH/高浓度钙处理 PEG处理 电融合,融合前,融合中,聚乙二醇（PEG)介导的体细胞融合,PEG带微弱极性的负电荷，能与水、蛋白质和碳水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。当PEG分子链足够大时，在邻近原生质体表面之间起着分子桥的作用，引起原生质体紧紧粘连成团。Ca2+在蛋白质或磷脂负电荷基团和PEG之间形成桥梁，加强原生质体之间的粘连作用。在洗涤过程中，直接或间接与质膜结合的PEG分子从原生质体表面洗脱，并随着pH值的降低，导致膜电荷的不平衡和发生重新分布。质膜紧密接触区域的电荷重新分布使一个原生质体的某些正电荷基团与另一个原生质体的负电荷基团联结，反之亦然，最后导致原生质体发生融合。融合细胞在培养过程中再生细胞壁、分裂生长形成愈伤组织和再生植株，产生体细胞杂种植株。,三 仪器、材料和试剂,1.仪器： 离心机、摇床、分析天平、pH计、80m细胞筛、镊子、烧杯、胶头吸管、移液枪、双目显微镜、注射器、三角瓶 2.材料： 菠菜叶片,3.试剂： 1液：0.16M CaCl2，0.1% MES，pH5.7 2液：0.24M CaCl2，pH5.7 3液：22% 蔗糖，pH5.7 4液：0.65M 甘露醇，0.05M CaCl2，0.1% MES，pH5.7 A液：8mmol/LCaCl2，30% PEG，0.7mmol/L KH2PO4，0.2mol/L甘露醇，pH 5.7 B液： 100mmol/LCaCl2， 0.7mmol/L KH2PO4，pH 10,四 实验步骤,1.原生质体的分离与纯化 酶液：2%纤维素酶，1%果胶酶，以10ml 4液溶解定容，4000rpm 离心6min，上清液置于三角瓶中， 取菠菜叶片撕去下表皮，每小组0.2g切成小块放到10ml酶液中，在26下，避光酶解45小时 酶解产物以80目细胞筛过滤，吸取4ml过滤液置于离心管中，700rpm，5min，弃上清 以1液重新悬浮沉淀，定容至4ml。另取离心管内注入6ml 3液，将4ml 悬浮原生质体，轻缓铺于蔗糖溶液上，1000rpm，510min,以20ul 枪吸出中间层置于2ml离心管中，勿触及下层蔗糖溶液，以 2液 800rpm，3min，离心清洗，弃上清，定容至2ml 1液中，以胶头滴管吸取置于载玻片上镜检,2.原生质体的融合 取2ml原生质体悬浮液，逐滴滴入平皿中，静置35min，逐滴滴加A液，静置1520min，轻轻摇动平皿，再逐滴滴加B液，静置1020min 以 1 液 收集平皿中液滴，以胶头滴管吸取置