肉桂地链霉菌的发酵工艺优化.ppt

肉桂地链霉菌的发酵工艺优化,张洁,选取高产菌株 作为底盘细 胞,底盘细胞,培养,形成单菌落,发酵,接合转移,构建转化体系,ST021菌株,对底盘细胞的目标产物进行验证,ST021发酵工艺的优化 种子培养基:糊精 2%，豆粕粉1.5%，葡萄糖0.5%，酵母提取物0.25%，用NaoH调PH6.7-6.8. 再加入CaCO3 0.1% 发酵培养基：葡萄糖4.5%，豆粕粉4%，硫酸钠0.22%，硝酸钠0.22%，氯化锰0.033%，硫酸铝0.007%，硫酸亚铁0.01%，抗坏血酸0.00019%，硫酸氢二钾0.00075%，碳酸钙0.25%， PH 6.7-6.8,第一批发酵第六天测得ST021的效价为：0.32g/L 第二批发酵第七天测得ST021的效价为：2.43g/L,存在问题,1.发酵过程中PH过高,培养1天后的种子液PH：8.05左右 第一批培养6天后的发酵液PH：8.64 第二批培养7天后的发酵液PH：7.25,计划：,1.继续优化ST021的发酵工艺，使其能够达到理想的效价。 2.继续做ST021的结合转移，构建其转化体系。 3.设计并敲除ST021聚酮合成基因，为埃霉素基因的导入做准备。,1.ST021抗性筛选,将ST021分别划线于含有Apr、Kan、Chl、tsr菌素的高氏培养中，观察知ST021对Apr有抗性，部分对Kan有抗性。,3.ST021转化体系的建立,1.与游离型质粒的结合转移 对ST021与W菌进行结合转移，将不同形态的菌落涂到含Apr和Nali的高氏培养基上，验证，然能生长。,2 整合型质粒的结合转移 将ST021与整合型质粒PIB进行结合转移，长出转化子，涂到含有Apr和Nali的高氏培养基上，仍能生长，待提基因组，验证整合到基因组的哪个位点上。,ST021单菌落发酵,不同浓度豆油发酵,ST021单菌落发酵,ST021-Kan单菌落发酵,对之前筛选出来的高产菌株N4、N6、Kan-2重新进行发酵。,对N-4、N-6补加豆油发酵，第七天测发酵效价,结合转移,对ST021与整合型质粒进行结合转移，长出疑似转化子，用pIB的验证引物进行验证，证明PIB已经整合到ST 021的基因组上。,Kan-2单菌落发酵,N4单菌落发酵,N6单菌落发酵,Kan-2单菌落发酵,N4单菌落发酵,N6单菌落发酵,ST021的敲除体系,MonB，调控基因R的敲除载体构建好，进行结合转移， 并长出转化子，将转化子划线于涂有Apr和Nali的板子上进行验证。 调控基因R敲除载体构建好，进行了多次结合转移。,构建调控基因MonH的敲除载体，利用重叠延伸的方法将其同源臂及Apr片段连接起来。,ST021发酵(新的发酵培养基),ST021发酵(新的发酵培养基),ST021敲除体系,调控基因R（负调控基因）进入到松弛培养第五代，第四代在Apr、kan板上均能生长。 调控基因R（正调控基因）进入到松弛培养第四代，挑单菌落30个于高氏培养基上。 调控基因MonH （正调控基因）挑了20个转化子在Apr、Nali的高氏培养上验证。 MonB进入到松弛培养第三代，挑单菌落20个于高氏培养基上生长。 正在构建ST021全基因敲除的载体。,ST021抗性筛选,将ST021分别划线于含有潮霉素、壮观霉素、新霉素的高氏培养中，观察ST021对这三种抗生素的抗性。,外源基因簇导入到ST021菌株中,分别将含有iso-migrastatin、Rapamycin基因簇的质粒转入到ST021的菌株中，等转化子长出后，检测这两种抗生素在ST021中的效价。,ST021敲除体系进展,改用液体培养基对构建的敲除菌株进行松弛培养。传2-3代之后用水把培养基洗掉，将菌丝体涂在抗性培养基上进行筛选。,调控基因Mon（正调控基因）出现双交换的个体，待提基因组验证（？）。 在斜面培养基上，MonB与调控基因MonR、MonR均出现恢复到野生型的个体，继续采用液体液体培养基对其进行传代。,ST021全基因敲除,同样采用-Red重组系统进行全基因敲除，在ST021的阅读框外分别选取未知功能域处长度为3211bp、3196bp作为上、下游同源臂。 将Apr片段置换到上、下游同源臂之间，待酶切验证。,将林春燕构建好的带有部分埃博霉素基因簇的游离型质粒Cos002、整合型质粒Cos004进行结合转移转入到ST021。目前Cos002长出转化子，待验证。,将ST021原始菌株，进行单交换菌株 R分别涂在Kan浓度为100ug/ml 、120ug/ml、150ug/ml、180ug/ml、300ug/ml、500ug/ml的斜面培养基上,分别看其所对应的抗性浓度。,继续对 R、 R、 H进行液体传代，每两天传代一次，然后吸取5ml菌丝体，用无菌水洗3次，涂在Apr的斜面