色层分析法之原理与应用.ppt

色層分析法之 原理與應用,黃平志,色層分析法之定義與原理,色層分析( chromatography)簡稱層析。 係一種分離技術。 操作過程：利用含混合物之移動相(mobile phase)流經固定相(stationary phase) 。 分離機制： 混合物中各成分在固定相和移動相之間的分配係數不同(即親和力不同) 。 各成分移動速率不同，而達到分離之目的。 化合物與靜相親和力較強，則沖提較慢(即滯留時間長) 化合物與移動相的親和力較強，則沖提較快(即滯留時間短)。,色層分析法之發展,20世紀初，Tswett發現當溶有植物萃取液之石油醚倒於內含碳酸鈣顆粒之玻璃管柱，再加入石油醚使其自然流下時，植物色素被分離而於管柱內呈現不同顏色之色帶。 氣相層析儀。 HPLC。 離子層析、超臨界流體層析,層析分離示意圖,層析之原理,t : Retention time 滯留時間,層析之分類,依兩相之物理性質分類： 氣相層析法(GC)：以氣體為移動相 氣固層析法(GSC) 氣液層析法(GLC) 液相層析法(LC)：以液體為移動相 液固層析法(LSC) 液液層析法(LLC) 超臨界流體層析法(SFC),層析之分類,依固定相之使用型式分類： 管柱層析法(Column Chromatography) 平面層析法(Planar Chromatography) 於平面介質上進行分離 濾紙層析法(Paper Chromatography) 薄層層析法(Thin Layer Chromatography),層析之分類,依分離原理分類 吸附式層析法 分配式層析法 離子交換式層析法 大小排除層析法 Affinity 層析法,層析圖及相關名詞介紹,基線：於正常操條件下，僅有流動相通過檢出器時之訊號曲線。 層析峰：由管柱流出之成分於通過檢出器時之產生之訊號對時間曲線。 峰高：由峰最大值至峰底之距離。 層帶寬度：峰寬 半高峰寬 峰面積：峰與峰底間之面積,W,h,Wh/2,層析圖及相關名詞介紹,無感時間( dead time, tM )：不被固定相所滯留之成分由進入系統至檢出器呈現其最大訊號之時間，代表流動相經系統到檢出器所需之時間。 滯留時間( retention time, tR )： ：成分由進入系統至檢出器呈現其最大訊號之時間。 調整滯留時間(tR )： 減去無感時間之滯留時間。,W,h,Wh/2,層析圖及相關名詞介紹,無感體積(VM)： 不被固定相所滯留之物質由進入系統至檢出器呈現其最大訊號時需之流動相體積。 滯留體積 調整滯留體積 相對滯留值(relative retention value)或分離因子(selectivity factor)：在相同操作條件下，成分與參考成分調整滯留時間之比。,W,h,Wh/2,影響分離效果之因子,分配係數(partition coefficient) 容量因子(capacity factor) 選擇因子(separation factor) 柱效率及理論板數 解析度(resolution),分配係數(partition coefficient)及容量因子(capacity factor),分配係數：平衡時，成分在固定相及移動相中的濃度比(溶質在不互溶或僅稍互溶之二溶劑間的分配關係) K = CL/CM 容量因子：平衡時，成分在固定相及移動相中的質量比 k = CL VL/CM VM = KVL/VM = (tR- tM)/tM = tR/tM 選擇因子或分離因子,柱效率及理論板數,平板理論 N:理論平板數 number of theoretical plates N=16(tR/W)2 H: height equivalent of a theoretical plates 理論平板等效高度(平板厚度) H=LW2/16tR2 L: column length 管柱長度 L=NH N=L/H,解析度 Resolution,Rs=Z/(WA/2+WB/2),如何增加解析度,增加理論板數(N)：即增加管柱長度或減小理論板高 增加選擇因子(分離因子), 1.0 1.001 1.01 1.1 1.5 2.0 (-1)/ 0 0.001 0.01 0.091 0.38 0.50,改變固定相，柱溫(GC)，流動相(HPLC) 改變容量因子：,k 0.5 1.0 3.0 5.0 8.0 10.0 30 50 k/(1+ k) 0.33 0.50 0.75 0.83 0.89 0.91 0.97 0.98,影響層析峰寬之因素,渦流擴散(eddy diffusion) 縱向擴散(longitudinal diffusion) 非平衡質量傳送(nonequilibrium mass transfer) 控制因子：流動速率、填充物粒徑、擴散速率、固定相厚度,van Deemter equation,導出流動相流動速率與之關係式 H = A + B/u + Cu A：渦流擴散項(多徑項)，由粒徑、幾何形狀及固定相填充緊密度有關A=2dp B：縱向擴散項(分子擴散) C：質傳阻力項,Partition Packing,Packed Columns,Liquid Phase,Solid Support,Very porous with very high surface area,van Deemter equation,van Deemter equation,層析法之定性分析,依據滯留時間定性 與己知物對照 雙管柱對照 利用化學性質定性 利用選擇性檢出器（雙檢出器系統）定性 與其他儀器結合定性：GC-MS, FT-IR,層析法之定量分析,一定分析條件下，待測成分於檢出器產生之訊號與其量成正比：a.峰高 b.峰面積 c.積分儀之應用 校正因子：各成分於檢出器產生之訊號不同，即靈敏度不同 絕對校正因子：fi = mi/Ai mi = fi x Ai 相對校正因子：fi = mi/Ai, fs = ms/As fi = (mi/Ai/) (ms/As) = miAs/msAi 定量方法： 歸一法(normalization method)：適用於各成分均能流出並被檢測之狀況 操作條件應維持不變 應適用於線性範圍內 樣品注入量較不需嚴格控管 外標準法： 內標準法： 標準添加法,氣相層析法,以氣體作為移動相之層析法，移動相與分析物質不起作用 氣相層析法之特點 高選擇性。 高效能。 高靈敏度 分析速度快。,氣相層析儀,管柱,樣品注人器,偵檢器,資料擷取及儀器控制用電腦,典型之氣相層析儀構造,載流氣體,氫氣,空氣,兩段式調壓閥,氣相層析儀,氣體供應系統 樣品注入系統 管柱 管柱恆溫控制器(烘箱) 偵檢器 數據處理系統,氣體及管線,載流及偵檢器支持氣體之品質需求Carrier and Detector Support Gases,氣相層析儀,流量控制 流量控制閥中裝有限流器 鋼瓶壓力亦需適當調整 載流氣體必須是高純度，且需在氣體鋼瓶和氣相層析儀間加裝純化裝置，以去除氣體中的微量水氣和氧氣 樣品注入系統 手動注射 自動注射 吹氣捕捉,分流/不分流注入口 Split/Splitless Inlet,SEAL,(INLET),(SEPTUM),SPLIT VENT,TOTAL FLOW,COLUMN,SEPTUM,= CARRIER GAS,LINER,50 mL/min,2 mL/min,0.6 mL/min,48 mL/min,47.4 mL/min,PURGE VENT,PURGE VALVE,Split Flow Diagram: Pre-Injection,吹氣捕捉裝置,層析管柱之種類Column Types,LENGTH (meters),I.D. (mm),.5-10,2-4,5-100,.530,5-100,.1-.25,PACKED,SERIES 530,NARROW BORE,填充管柱 Packed,毛細管柱 Open (Capillary),Wall Coated,Open Tube,管柱-填充管柱,玻璃管柱 長 1.5至 3 m 內徑 2至 4 mm 內部填充表面被覆一層液相的小固體顆粒( 60至100篩目的矽藻土或碳化物),管柱-毛細管柱,開口式玻璃毛細管柱 長 15至 100 m 內徑 0.2至 0.75 mm 管柱裡面塗敷一層液相，現在大部分的毛細管柱是使用熔矽材質，而玻璃管柱也仍被用來分析揮發性有機物 毛細管柱的分離效果比填充管柱好,10% of Applications,Gas Solid Chromatography (GSC),Partition Packing,Packed Columns,Liquid Phase,Solid Support,Very porous with very high surface area,Gas Liquid Chromatography (GLC),Gas Liquid Chromatography (GLC),Parameter effect on R down sides Column length the longer the better longer elution time Film thickness the thinner the better smaller sample loads poor retention for extremely volatile compounds Inner diameter the smaller the better smaller sample loads,Summary of column parameters on Resolution,不同型式管柱性能之比較 Comparison of Column Types,Packed Column Analysis:,Capillary,Conventional,5% OV101,on 80/100 Chromosorb,30m X 0.53mm X .88m,30m X 0.32mm X .25m,HP Column Evaluation Sample,理想偵檢器特性,適當靈敏度(Sensitivity) 穩定性(Stability)及再現性(Reproducibility)佳 適當線性範圍(Linear dynamic range) 適當溫度範圍 反應時間(Response time)短且不受載流氣體流速影響 內容積小以避免溶質帶變寬 對所有溶質都有類似訊號或對一或多種類型溶質具選擇性感應 對溶質沒有破壞性 高可信度且使用方便,熱傳導度偵檢器 Thermal Conductivity Detector (TCD) 火燄離子化偵檢器 Flame Ionization Detector (FID) 電子捕捉偵檢器 Electron Capture Detector (ECD) 氮磷偵檢器 Nitrogen Phosphorus Detector (NPD) 火燄光度偵檢器 Flame Photometric Detector (FPD),氣相層析儀偵檢器,電解導電感應偵檢器 El