实时荧光定量PCR技术在番茄研究中的应用.pdf

自 pcr 技术问世以来， 在生物医学领域得到 广泛的应用，并不断衍生出许多新的技术使其应 用泛围不断扩大， 特异性和敏感性也不断提高。 实 时定量 pcr （real-time polymerase chain reaction, real-time pcr） 技术就是基于 pcr 技术基础上提 出的 1， 该技术于 1996 年在美国 applied biosys tems 公司研究成功。目前，已广泛应用于植物学 研究、 医学研究、 海关检疫等领域1-3。近几年， 实 时荧光定量 pcr 技术也有力地提高了番茄各研 究领域的水平， 而且发挥着越来越重要的作用， 笔 者将重点在这方面进行综合论述。 1realtime pcr技术原理 所谓的实时荧光定量 pcr 就是通过对 pcr 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检 测， 从而实现对起始模板定量及定性的分析。 在实 时荧光定量 pcr 反应中， 引入了一种荧光化学物 质， 随着 pcr 反应的进行，pcr 反应产物不断累 计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循 环， 收集一个荧光强度信号， 这样就可以通过荧光 强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光 扩增曲线图。在 pcr 指数扩增期间， 通过连续监 测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的 量,并据此推断目的基因的初始量4-5。 实时荧光定 量 pcr 的化学原理可分为两大类： 探针类和非探 针类，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来 指示扩增产物的增加， 如 taqman 探针、 分子信标 等， 建立在荧光能量共振转移原理 （fret） 上6； 非 探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来 指示扩增的增加，常用的有 sybr green 和 lc green。前者由于增加了探针的识别步骤， 特异性 更高， 但后者则简便易行。 由于实时荧光定量 pcr 技术能在 pcr 整个 植物生理与生物技术 实时荧光定量 p c r 技术在番茄研究中的应用 郝志愚， 金凤媚， 薛 俊， 宋 建 （天津市农业生物技术研究中心， 天津 300384） 摘要： 随着实时荧光定量 p c r技术的不断完善和发展， 该技术越来越受到人们的青睐。它以快速、 灵敏、 高特异性和安 全性高等优点广泛应用于科学研究等各个领域。近年来， 实时荧光定量 p c r技术在番茄的各研究领域不断深入， 大大提 高了番茄的病害检测能力、 特异基因的表达水平和转基因的检测效率。 关键词：实时荧光定量 p c r ； 番茄； 检测 中图分类号：s641.2文献标识码：adoi编码：10.3969/j.issn.10066500.2014.05.010 application of real-time fluorescence quantitative pcr in tomato hao zhi-yu, jin feng-mei, xue jun, song jian (tianjin research center of agricultural biotechnology, tianjin 300384, china) abstract: with the development of real-time fluorescence quantitative pcr technology, more attention was paid to the technology. it was a fast, sensitive and highly specific technology and have been used widely in various fields of scientific research. in recent years, real-time fluorescence quantitative pcr technology has been applied on the research of tomato. it greatly improved the de- tection of transgenic tomato , tomato disease and specific genes expression. key words: real-time fluorescence quantitative pcr; tomato; determination 收稿日期：2014-02-14；修订日期：2014-03-17 基金项目：天津市农业科学院院长基金项目 （13014） 作者简介：郝志愚 （1985） ， 男， 天津人， 研究实习员， 主要从事番茄的栽培研究。 通讯作者简介：金凤媚 （1977） ， 女， 天津宝坻人， 副研究员， 硕士， 主要从事番茄的分子育种工作。 2014，20（5）：43-46天津农业科学 tianjin agricultural sciences 天津农业科学第 20 卷 扩增反应过程监的每一步循环中检测扩增产物扩 增情况 , 也可以精确定量起始样品的量，因此被 认为是一项具有革命性的技术。 2实时荧光定量pcr的特点 2.1速度快， 简单便捷 实时荧光定量 pcr 是在一个封闭的反应体 系中进行， 不需要电泳、 染色的步骤， 其操作步骤 大大减少。 而且实时荧光定量 pcr 仪采用了新的 升降温机制， 从而大大缩短了扩增反应的时间， 一 般整个过程只需 2 h。与常规 pcr 相比,实时荧光 定量 pcr 的一个主要优势是可以快速提供可靠 的数据7。 2.2灵敏性高 实时定量 pcr 技术结合了光谱技术和计算 机技术,其检测的灵敏度得到了很大的提升， 检测 的最低 dna 浓度可达 pg 级水平 8。当样品中的 dna 量很低时, 用紫外光度法和凝胶斑点定量法 测定几乎不能检测到时, 采用实时荧光 pcr 技 术,除了可以提供 pcr 扩增的信息外,还可以了解 dna 浓度。对番茄溃疡病检测的结果表明， 实时 荧光定量 pcr 比普通的 pcr 检测结果灵敏度高 100 倍左右9。 2.3高度的特异性 由于在 pcr 反应体系中加入了荧光探针, 该 探针是针对靶序列设计， 使得非特异性产物不能 与探针杂交，尤其对与特异性产物分子量接近、 通过电泳无法分开的产物更为有效，相当于在 pcr 的过程中自动完成了 southern 杂交，具有高 特异性。 2.4安全性高 实时荧光定量 pcr 是在全封闭状态下实现 扩增和产物分析的, 不需要用溴化乙锭 （eb）染 色， 降低了对环境和操作人员的污染。 3pcr技术在番茄研究中的应用 目前， 实时荧光定量 pcr 已作为一个实用的 方法被应用于番茄病害检测、转基因的检测和基 因表达的研究等方面。 3.1在番茄病害检测中的应用 1999 年 bohm 等10首次将实时定量 pcr 方法 应用于植物病理学研究。自此之后， 这种技术在小 麦、 水稻、 马铃薯等作物的病害上得到了广泛的应 用。在番茄的病毒病检测中也起到了重要的作用。 朱建裕等 11 根据番茄环斑病毒 ( torsv) 各株系 rna1 聚合酶基因的保守序列， 建立了对 torsv 的 实时荧光 rt-pcr 检测方法。该方法利用 taqman 荧光探针实时监测目的基因的扩增, 实现 rt-pcr 扩增与探针检测同时进行,不需 pcr 后处理，消除 了 pcr 产物的污染， 不需电泳和 eb 染色， 减少了 检测步骤, 节省了时间。林铭等12和阮美颖等13针 对目前番茄生产中为害严重的 tylcv 病毒分别用 sybr green i 检测模式和 taqman 探针进行了实时 荧光定量 pcr 检测的研究， 通过比较普通 pcr 与 荧光定量 pcr 的灵敏度，发现后者的灵敏度比前 者高 100 倍，采用荧光定量 pcr 方法可以检测到 微量病毒。这就为及早发现病毒、 提早防治提供了 技术保证。另外， 该方法还被应用在番茄斑萎病毒 （tomato spotted wilt virus ， tswv ） 和番茄不孕病毒 ( tomato aspermy virus, tav )的检测中， 整个检测过 程仅需 2 h, 被证明是一种操作简便、特异性强、 灵 敏度高、 快速有效的 tav 检测方法14-15。 实时荧光定量 pcr 技术除了应用于植物病 毒病的检测外， 还可用于植物病原细菌的检测。 由 clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (cmm ) 引起的番茄细菌性溃疡病是一种严重危害番茄生 产的种传细菌性病害。 夏明星等9根据 its 序列多 态性设计引物及 taqman 探针进行实时荧光 pcr 检测的结果表明，这组引物-探针能检测出所有 供试的 cmm 菌, 对照菌均未检测到荧光信号。用 接种但未显示症状的番茄苗叶片及人工处理的带 菌种子提取的核酸作为模板, 均能检测到病菌, 其检测灵敏度比常规 pcr 高约 100 倍。试验中不 需病原菌的分离培养及 pcr 的后续处理。该方法 快速、 简便、 安全、 准确, 适用于出入境检验检疫 及种子、 种苗健康检测领域9， 16。 3.2转基因的检测 转基因作物自从 1996 年进行商品化种植以 来,全球转基因作物种植面积持续增长。番茄转基 因技术也得到长足发展。 目前， 实时荧光定量 pcr 已经成功的应用于检测转基因番茄的研究中。转 基因产品的检测主要有两个方面：一个是定性检 测， 即看其是否为转基因植株， 另一方面是看转化 基因的表达量即定量检测。 44 第 5 期 mason 等17通过研究番茄转基因植株 3 个外 源基因的表达证实，实时定量 pcr 技术相比于 southern 杂交等其他技术而言， 操作简单， 不需要 特别的条件优化， 具有更为快速、 准确等特点。在 定性检测上， 梁彦君等18利用实时定量 pcr 技术 从转基因番茄华蕃一号中成功检出 35s、 nos、 nptii、 35s-efe 和内参基因 lat52， 阴性对照番茄 合作 903 中只有内参基因 lat52 检出，为我国番 茄转基因检测提供参考。同时，比较了实时定量 pcr 与 nothern blot 技术的检测结果， 建立了一套 更为精确、完善的检测植物基因差异表达的 pcr 体系。王伟伟等19利用该技术对转基因番茄中携 带的潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因进行了检测， 避 免了普通 pcr 经常出现的假阳性, 具有准确性。 在定量检测上， moon 等20利用实时定量 pcr 技术有效地区分出转基因番茄的外源基因在叶 片、 花和果实中 rna 的转录水平。魏振林等21利 用该技术研究了转 mi1.2 基因的番茄植株表达水 平的检测体系，为转基因番茄植株的高通量筛选 奠定基础。 3.3基因差异表达分析 如前所述，实时实量 pcr 检测的灵敏度很 高，所以该项技术也被用在了番茄中含量低的基 因的检测和定量研究上。 mirnas 是在真核生物中 发现的一类内源性的具有调控功能的非编码 rna， 参与了包括生物代谢、 发育、 疾病发生等各 种重要的生理过程。 该类 rna 在生物体内的表达 水平存在明显差异， 且含量较低， 传统的检测方法 很难达到精确的检测， 而实时定量 pcr 的出现则 为比较基因组学研究提供了可靠的方法和技术。 刘辛等22利用 stem-loop 荧光定量 rt-pcr， 分析 了黄瓜花叶病毒株系和番茄不孕病毒侵染番茄 后， 不同侵染时期、 不同寄主组织中的 7 条 mir na 及其部分靶标 mrna 对病毒侵染的响应， 探 讨了不同病毒与寄主互作过程中寄主 mirna 调 控途径的改变和影响。谢小玉等23利用该项技术 研究了番茄蔗糖转运蛋白 （sut1）在不同栽培条 件下不同器官的表达差异，为番茄的高产优质栽 培技术的建立提了理论依据。 4讨 论 随着科技水平的不断发展， 越来越需要快速、 有效、 精确定量的技术， 实时荧光定量 pcr 技术 相对于传统检测技术优势更明显。但由于实时荧 光定量 pcr 技术也有其固有的缺点， 如对设备要 求较高，荧光探针成本较大，必须使用转用耗材 等， 从而使得检验成本大大提高。 所以一般的实验 室很难利用该技术。另外， 实时荧光 pcr 技术对 各反应参数也要进行严格的优化，比如通过检测 sybr green 染料荧光而获得的扩增曲线有可能 是非特异性扩增，所以设计和筛选特异性引物可 以大大降低其假阳性几率。还有在 pcr 反应加样 时 dna 模板浓度不要太高，否则会抑制和干扰 pcr 反应， 使扩增效率降低24。 虽然这项技术还存在着一些不足，但它的应 用前景还是令人鼓舞的。笔者相信随着各种分子 生物学技术的不断发展，采用多领域多技术相结 合的方法，可以实现单个技术所不能达到的研究 水平和效果。实时定量 pcr 技术必将在番茄的各 项研究领域中发挥更大的作用。 参考文献： 1 施林祥, 李东辉. 荧光 pcr 研究新进展 j. world chi nese journal of digestology, 2005， 13(5):596-599. 2 高斌,刘敬忠.实时荧光 pcr 技术的研究及其应用进展 j.诊断学理论与实践,2005,4(6):507-508. 3 mikael k a, jose m a, martin b,et al. the real -time polymerase chain reaction j. molecular aspects of medicine, 2006, 27:95-125. 4 田义轲， 李节法， 王彩虹， 等.梨茎尖中 ppko 基因表达 量的实时荧光定量 pcr 分析j.华北农学报,2012(3):62- 66. 5 张华, 许叔祥. 定量聚合酶链式反应的研究进展与临 床应用j.中华检验医学杂志, 2000,23(2) : 120-121. 6 clegg r m. fluorescence resonance energy transfer j. curt opin.biotechnol, 1995, 6(1):103-110. 7 claire g, ammaick m, benedicte c. 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