还原糖-砷钼酸比色法.ppt

实验五,还原糖含量的测定 -砷钼酸比色法,基础生物化学,一、糖,1. 糖的生理功能 (1)分布广泛的有机化合物,它是某些植物种子、根、茎的重要组成部分，也是蔬菜、水果等的重要组成部分。 (2)维持生命活动的主要能量来源。 (3)是许多植物和微生物细胞壁的重要组成部分。,2.测定的意义,(1)在植物组织中，糖含量可高达80%左右，在动物和人组织中，含量较少，约为干重的2%。 (2)植物中糖的种类和含量分析，对于选种及控制培育条件有重要的意义。 (3)在微生物发酵中控制培养基中糖等物质的含量，对指导生产实践很重要。 (4)在医学方面根据血糖或尿糖含量的高低诊断某些疾病。,3.测定的方法,(1)根据糖溶液的折射率、比重、旋光活性等物理性质，可用折射仪、波美比重计、旋光仪来测定糖含量。 (2)根据糖的化学性质可用滴定法、比色法定量测定，此外还有氧电极、酶电极等快速微量的定糖方法。,二、实验目的,1.了解还原糖的生理意义及作用。 2.掌握砷钼酸比色法测定还原糖的基本原理和操作方法。,三、实验原理,还原糖：指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。 利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来。 对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。,1、砷钼酸比色原理,（1）还原糖在碱性条件下加热，可以定量地还原二价铜离子为一价铜离子，即产生砖红色地氧化亚铜沉淀，其本身被氧化。具体反应如下：,（酒石酸钾钠）,砖红色,（2）氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原型地钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生成一种蓝色复合物即砷钼蓝，其颜色深浅在一定范围内与还原糖地含量(即被还原的Cu2O)成正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后做标准，就可测得样品还原糖含量。,2、测定还原糖其它方法,(1)蒽酮比色法： 强酸可使糖类脱水生成糠醛，糠醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，其颜色的深浅与糖含量成正比关系，在620nm波长下可测定其光密度值。,(2) 3,5-二硝基水杨酸： 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。,(3)费林试剂滴定法 费林试剂由甲乙两种溶液混合而成，甲液(硫酸铜)与乙液(氢氧化钠)生成天蓝色沉淀，在碱性溶液中，乙液(酒石酸钾钠)使氢氧化铜溶解生成一种络合物，还原糖在碱性加热条件下，可以定量还原费林试剂中Cu2+为Cu1+,使费林试剂脱色，其脱色的程度与还原糖含量成正比关系。,四、实验材料、主要仪器和试剂,1实验材料 ：苹果 2仪器 （1）恒温水浴锅 （2）Spc22-可见分光光度计（3）容量瓶（4）漏斗（5）研钵 3试剂 （1）铜试剂：CuSO4、酒石酸钾钠、Na2SO4、Na2CO3、NaHCO3 （2）砷钼酸试剂：（NH4)6Mo7O244H2O、Na2HAso47H2O （3） 200g/mL葡萄糖标准液,1、制作标准曲线: 取7支试管，按下表操作，然后以标准葡萄糖浓度为横坐标，对应的吸光值为纵坐标绘制标准曲线。,五、实验步骤,标准葡萄糖溶液浓度(ug/ml),OD值,0,样品OD,C0,2、还原糖的提取,称取0.25g苹果于研钵中加约30ml蒸馏水由漏斗冲入50ml容量瓶，摇匀80水浴浸提30min冷却加3mlZnSO4加3ml0.3N的Ba(OH)2振荡后静置上层出现清液后再加一滴Ba(OH)2至无白色沉淀定容至50ml。,3、还原糖含量的测定,过滤提取液取滤液0.5ml于50ml容量瓶中定容取稀释液2ml于刻度试管中加铜试剂2ml煮沸10min加砷钼酸试剂2ml振荡2min定容到20ml620nm下比色测定记录结果查标准曲线。,五、结果与计算,在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖百分含量。 还原糖(%)=,W106,100,稀释倍数