GABA茶中γ-氨基丁酸的TLC测定及提纯研究.pdf

氨基酸和生物资源2 0 0 8 ， 3 0 ( 3 ) ： 1 1 1 5 Amin o Ac i 出 Bi o t i c Re s o u r c e s G A B A茶中 y 一 氨基丁酸的 T L C测定及提纯研究 黄亚辉 ， 曾 贞 ， 郑红发 ， 黄怀生 ( 1华南农业大学园艺学院， 广州 ， 5 1 0 6 4 2 ； 2湖南省茶叶研究所 ， 长沙 ， 4 1 0 1 2 5 ) 摘要： 本文对 G A B A茶中有效成分 一氨基丁酸的薄层扫描( T L C ) 检测以及提取、 分离、 纯化进行 了研究 ， 结果表明： 正丁 醇 ： 醋酸 ： 水体积比为 4 ：1：1展开剂分离效果较好， R f 值为 0 4 6 。采用双波长扫描法检测， 扫描波长分别为 A S= 5 1 5 n m， A R= 6 8 0 n m， 检测线性范围： 0 5 Ix L1 5 u L， 样品平均回收率为 9 8 7 5 。采用水提取法 比乙醇提取法 一氨基丁酸含 量提高 2 0 左右， 7 3 2阳离子树脂对 一氨基丁酸的静态最大吸附量为 3 2 9 mg g ， 1 h内其吸附速度较快， 达吸附量的 7 0 。样液 p H值 、 流速等因子对树脂的吸附效率有影响， 当 p H值为 3 0， 流速 3 ml mi n 时，树脂的吸附量达到最大值。 采用柠檬酸缓 冲液和 N H H ： O进行洗脱 ， 当 p H为 8 0 9 0时 ， 一 氨基丁酸洗脱率达 9 4 6 8 。 关键词： 一氨基丁酸； 测定 ； 提取 ； 分离； 纯化 中图分类号： Q 5 0 3 文献标识码： A 文章编号： 1 0 0 6 8 3 7 6 ( 2 0 0 8 ) 0 3 0 0 1 1 一 O 5 y 一氨基 丁酸 ( G A B A) 广泛存 在于哺乳动物脑 和脊髓 中， 是一种重要的抑制性神经传递物质 ， 具有 降血 压、 抗 惊厥 、 镇 痛和 改善记 忆等 生理 活性 。 最新研究表 明还有调节激素分泌 ， 改善更年期综合 症 ， 促进酒精代谢 以及高效减肥等活性_ 2 - 4 。 日本 茶学研究者首先发现 ， 将茶鲜 叶经过一定时间的厌 氧处理会产生大量的 一氨基丁酸 ， 以此加工成的 绿茶富含 一氨基丁酸 ( 含量一般在 0 1 5 以上 ) ， 并且将这种茶命名为 G A B A茶 J ， 经试验证实这种 茶具有明显 的降血压效果 。我 国 G A B A茶研究 起 步较晚， 林智等对其降血压机理、 2 ， 4一二硝基氟苯 柱前衍生 H P L C测定法以及不同厌氧处理的效果进 行了研究“ 。 ； 黄亚辉等采用邻苯二甲醛 ( O P A ) 柱 后衍生 HP L C法对 一氨基丁酸进行 了测 定 ， 研究 设计干法和湿法工艺 ， 加工出 一氨基 丁酸含量 达 0 1 7 2 一0 3 5 0 的 G A B A茶 ， 其 中湿法工 艺获得 国家发明专利( Z L 0 2 1 1 4 1 5 6 8 ) ， 并对 G A B A茶的临 床降压效果 以及加工过程中各种游离氨基酸的 变化动态进行了研究 “ J 。 y 一氨基 丁酸对人体具 有许多积极的生理 意义， 然而对其 提纯方 面的研究 却不 多见 。本文对 T L C测定方法 以及提取 、 分离 、 纯化诸方面开展摸索 ， 旨在 为 y 一氨基丁酸成分 的 深度利用提供参考。 1 材料与方法 收稿 日期： 2 0 0 8 - 0 5 1 9 作者 简介 ： 黄亚辉 ， 男 ( 1 9 6 9一) ， 研 究员 ， 主要从 事茶 叶加工及 生化 研究 。E m a i l ： y a h u i h u a n g z z 1 2 6 c o m。 基金来 源 ： 国家科技部项 目( 2 0 0 1 B A 5 3 5 L一1 8 ) 研究内容之一。 1 1 实验材料与试剂 G A B A茶( 研究者 自制 ， 一氨基 丁酸质量 分数 为 0 1 5 以上) ， 粉碎 ， 过 2 0目筛备用 ； 一氨基 丁 酸标准品： 江苏三兴生化试剂厂 ； 阳离子交换树脂 ： 南开大学化工厂 ； 薄层层析硅胶 G( 青 岛海洋化工有 限公司) 。其它试剂均为分析纯。 1 2主要 仪 器设 备 C A MA G T L C S C A N N E R 3 ； 5 L微量点样针 ； 点 样毛细管( 5 L ) ； 旋转蒸发仪 R E 5 2 9 8 ( 上海亚荣 生化仪器厂) ； S H B一1 1 1 循环水式多用真空泵 ( 郑州 长城科工贸有 限公 司) ； A B 2 0 4一 S电子天平 ； 艾科 浦分析型实验室纯水机 ( 重庆颐洋企业发展有 限公 司) ； p 3 0 c m， 高 5 0 c m玻璃层析柱。 1 3 实验 方 法 1 3 1 一 氨基丁酸的提取 1 3 1 1水提取法 称取粉碎 G A B A茶 5 0 g 加入 去离子 水 2 0 0 mL _ 0 水浴浸提 2 h 一过 滤一 滤渣再用 2 5 0 mL 去离子水 6 0 C水浴提取 3 h 一过滤一合并两次滤液 减压浓缩至 5 0 m L ( 8 0 C) 一浓缩液 中加 2倍体积 9 5 乙醇醇沉_ 静置 2 h 一过滤一去乙醇得提取液 ， 点样 ， 薄层检测。 1 3 1 2乙醇提取法 G A B A茶粉碎样 5 0 g 一加 体积分数 7 0 乙醇 4 0 0 mL 一浸提 2 h 过滤_ + 保 留滤液 ； 滤渣_ 加体积 分数 7 0 乙醇 4 0 0 mL 一 浸提 3 h 一 过滤一 合并 滤 液； 滤渣体积分数7 0 乙醇3 0 0 m L 一浸提2 h 一过 滤 合并滤液 ； 滤渣弃掉 5 c I = 减压浓缩至 5 0 m L 5 0 0 0 r m i n 。 离心 1 5 m in 一取上层清液， 保留待用。 维普资讯 1 2 黄亚辉等 ： G A B A茶 中 一氨基 丁酸 的 T L C测定及提纯研究 1 3 2 一 氨基丁酸的检测 1 3 2 1展开剂的选择 一 般采用纸层析法对展开剂系统进行考察 ， 将 点好样 品( 水提液 ) 的滤纸板 ， 分别放进加有叔丁醇 ：乙酸 ： 水体积比为 6 9 5 ：2 9 5 ：1 ； 正丁醇 ： 醋酸 ： 水体积比为 7 ：3 ：1 ； 正丁醇：醋酸 ： 水体积比为 4 ：1：1 ； 正丁醇 ： 醋酸 ： 水体积比为 7 ：5 ：1的 不同溶剂系统的层析缸中进行单向展开。同时也采用 双向展开法对体积 比为正 丁醇 ：甲乙酮 ：水 ： 2 8 氨水 2 5 ：1 5 ： 7 ：3 ， 正丁醇 ： 乙酸 ： 水( 4 ：1 ：5 ； ( 丁醇 ： 乙酸 ： 水 6 9 5 ：2 9 5 ：1 ， 苯酚 ： 氨水 1：1 ； ( 丁醇 ： 乙酸 ： 水 4 ：1：5 ，问苯酚 ： 苯酚 1：1 三组展开溶剂系统进行考察。 1 3 2 2扫描波长的确定 取 一氨基丁酸标准品 ， 加蒸馏水溶解配成 1 g L 的标准溶液 ， 分别吸取标准品溶液 1 I,z L点于 吸附量( mg g )= 自制 的硅胶 G薄层板上 ， 以正丁醇 ： 醋酸 ： 水体积 比4 ：1 ：1为展 开剂， 取 出晾干后用体 积分数 0 2 茚三酮乙醇溶液显色， 1 0 5 C 烘数分钟， 直至获 得最大斑点 ， 进行薄层扫描。 1 3 2 3检测限和线性范围实验 在硅胶板上分别点 1 g L 一氨基丁酸标准 溶液 0 5 I x L 、 1 0 I x L 、 3 0 I z L 、 5 0 I x L 、 7 0 L 、 9 0 L、 l 2 L 、 1 5 L ， 按薄层层析条件展开， 茚三酮乙 醇溶液显色 ， C A MA G T L C S C A N N E R 3扫描仪扫描。 1 3 3 y 一氨基丁酸的分离与纯化 1 3 3 1阳离子交换树脂静态吸附实验 准确称取预处理好的树脂 5 0 g ， 装入具塞磨 口 三角瓶 中， 准确加 入 已知浓 度 的金 白龙茶 粗提液 1 0 0 m L， 恒温水浴振荡 2 4 h ， 充分吸附后 ， 过滤，测 定溶液中 一氨基丁酸的浓度 ， 同时按照下式计算 各种树脂 的吸附量 ： 吸附液初始浓度 一吸附液最后浓度( m g m 1 ) 溶液体积( m l 树脂质量( g ) 准确称取按照测定吸附量处理好 的树脂 5 0 g ， 过滤 ， 测定滤液 中 一氨基 丁酸 的浓度。按照下式 准确加入 1 0 0 m L N H ， H O ， 恒温水浴振荡 2 4 h ， 计算各种树脂的解吸率： 解 吸 率 c = 鱼 圣 旦 堕 葺 凳 名 l ； i 。 。 准确称取阳离子交换树脂 5 0 g ， 装入具塞三角 瓶中， 准确加入 已知浓度的金 白龙茶粗提液 5 0 m L， 恒温水浴振荡 ， 在 1 2 h内， 每小时取 0 5 mL测定其 一 氨基丁酸含量， 绘制静态吸附动力学曲线 。 1 3 3 2阳离子交换树脂动态吸附及洗脱实验 通过 7 3 2阳离子交换树脂对金 白龙茶粗提液的 静态吸附实验 ， 对 7 3 2阳离子交换树脂进行动态吸 附实验 ， 包括 洗脱流 速、 洗脱 液 p H 和上样液体 的 p H值 。将预处理好 的阳离子交换树脂装入玻璃层 析柱中 ， 将金白龙茶粗提液上柱 ， 控制一定 的流速， 分步收集 ( 2 mL 试管)， 当流出液 出现与标准品 同 一 线上的斑点时， 认为已经有 一氨基丁酸透过 ， 停 止上样 ， 然后按照不同 p H( 3 0 、 4 0 、 5 0 、 6 0和 8 0 9 0 ) 洗脱液进行洗脱 ， 分部收集 。按照下式计算 吸附量 ： 吸附量 ( m g )=上样液浓度( m g mL )流出液体积 ( mL ) 2 结 果与讨 论 2 1 展开剂的选择 通过纸层析， 对展开剂系统进行考察发现 ： 1 、 单 向展开能够完全分开 目标物质 ， 因而本实验不需要 进行双向展开操作 ； 2 、 正丁醇分离效果较叔丁醇为 优。在纸层析的基础上 ， 采用预制板和 自制硅胶板 进行实验。将点好样品的硅胶板， 在加有不同展开剂 的层析缸中展开， 结果表明， 以正丁醇 ： 醋酸 ： 水体积 比为4 ： 1：1 分离效果最好(见图 1 ) ， R f 值为0 4 6 。 图 1 正丁醇 ： 醋酸 ： 水体积比4 ：1：1展开指纹图谱 维普资讯 氨基酸和生物资源 1 3 2 2扫描 波长 的确 定 从图 2可以看出， 一氨基 丁酸在 5 0 0 n m处有 最大吸收峰， 6 0 0 n m后吸收降低。因而选择扫描波 长为 k S=5 1 5 n m， h R：6 8 0 n m。采用双 波长扫描 法， 一是为了避免分离度不佳的其他氨基 酸的相互 干扰 ； 二是双波长扫描可 以排除背景 干扰使基线平 直 ； 三能提高灵敏度。 图 2 y 一 氨基 丁酸标 准品光谱扫描 图 2 3 回收率与精确度 精确称取 已知含量 的样 品约 1 g ， 分别加人质量 浓度为 1 0 g L 的对照品溶液 3 、 5 、 8 mL ， 并按样 品测定方法点样、 展开、 显色后扫描， 测定其含量。 结果 ( 见 表 1 ) 平 均 回收率 为 9 8 7 5 ，R S D=2 2 1 (n= 6 ) 。 2 4检 测 限和 线性 范围 通过线性范围实验 ， 我们 发现 ， 当扫描 条件为 ： 反射式双波长锯齿扫描 ， k S= 5 1 5 n m， X R= 6 8 0 n m， 狭缝 5 0 0 4 5 m m。用最小二乘法对标准溶液点 样量和色谱峰面积值进行回归分析， 得到回归方程 A=1 3 1 7 2 9 C一6 8 3 2 6 ，相关系数 r = 0 9 9 5 2 ， 线性 范围 ： 0 5 Iz L一1 5 。金 白龙茶水提液 一氨基丁 酸质量浓度为 1 6 0 8 g L， 在此线性范围内。因 而本方法的检测底限为 0 5 I x L 。 2 5不 同提 取 方 法对 一氨基 丁 酸含 量的 影响 取水提液和乙醇提取液进行薄层分析 ， 提取液 中 y 一氨基丁酸的质量分数见表 2 ， 由表 2可知 ， 普 通茶 叶采用水提取方法 比采用乙醇提取方法 一氨 基丁酸质量分数要提高 2 1 4 ， 高 y 一 氨基丁酸实 验茶采用水提取方法 比采用乙醇提取方法 一氨基 丁酸质量分数要提高 1 9 3 ， 总体上看 ， 采用水提 取方法 比采用乙醇提取方法 y 一氨基丁酸含量要提 高 2 0 左右。 表 1 一 氨基 丁酸 回收率和精密 度的测定 2 6 7 3 2树脂静 态吸附试验 利用 7 3 2阳离子树脂对金 白龙茶中 一氨基丁 酸初提液进行处理 ， 在初始质量浓度 1 6 0 8 g L 的条件下 ， 测定其吸附后平衡浓度 (即树脂充分 吸 附或吸附达到平衡后) ， 可以得到7 3 2阳离子树脂对 金 白龙茶 中 y 一氨 基丁酸 的吸 附量为 3 2 9 m g g 。上述 方法 中充分 吸附 的树 脂再 利 用 N H H 0在 2 5 的条件下进行解吸， 测定解吸率为 9 8 0 8 。同时考虑吸附量 以及解 吸率 ， 对 7 3 2阳离子 树脂进行吸 附动力 学实验。实验结果 表明 ， 7 3 2阳 离子树脂在 1 h内的吸附速度非常快 ， 基本 已经超过 其吸附量的7 0 ， 到5 h 后已经超过了9 0 ， 见图3 。 从吸附量、 解吸率和吸附率三方面来考虑 ， 7 3 2阳离子 树脂均很适合分离纯化金白龙茶 中 一氨基丁酸。 m m m m 如 如 如 0 维普资讯 - 1 4 黄亚辉等 ： G A B A茶 中 一氨基丁酸的 T L C测定及提纯研 究 图 3 7 3 2阳离子树脂吸 附量与时 间关 系曲线 2 7 7 3 2阳 离子树 脂动 态吸 附 实验 将金 白龙茶 y 一氨基丁酸提取液调节成不 同的 p H( 2 0 、 2 5 、 3 0 、 3 5 、 4 0、 7 0 ) 上样 ， 进行吸附实 验( 图 4) 。从图 4可以看 出， 在样液 p H值 为 2 0 时， 树脂的吸附量 较低 ； 随着 p H值 的升高 ， 树脂 的 吸附量渐渐增加 ， 当 p H值为 3 0时， 树脂 的吸附量 达到最大值 ， 为 3 2 9 mg g 。 。 。随着 p H的进一 步 增大 ， 树脂的吸附量继而呈现下降的趋 势。造成此 种结果的原因是 y 一氨基丁酸本身就是一种酸性物 质 ， 同时也带有碱性基 团氨基 。在酸性环境 中 氨基结合一个质子而成 阳离子状态 ， 容易被树脂吸 附； 在碱性条件下羧基 电离一个质子而带负 电呈阴 离子状态， 从而使阳离子交换树脂的吸附量降低 。 一 ； 图 4 不 同上样 p H对 吸附量 的影 响 不同的吸附流速 ， 物质与树脂 的接触时间不 同， 所以吸附量也有所差异。将 一 氨基丁酸初提液按 照 1 、 3 、 5 、 9 mL mi n 的流速上样。从 图 5可以看 出， 当流速达到 3 m l m i n 时 ， 树脂的吸附量达到 3 2 9 m g g ， 当流速达到 5 m l mi n ， 树脂 的吸 附量 曲线几近平缓 ， 在 流速为 13 m lm i n 。 。 时， 虽然树脂的吸附量较高， 但是实验操作时间过长， 因 而将吸附流速控制在 3 m l m i n 最为合适 。 不同 p H的洗脱液对 一氨基丁酸的洗脱效果 不同， 将 吸附好 的树脂柱 分别 用 p H为 3 0 、 4 0 、 5 0 、 6 0和 8 09 0的柠檬酸缓 冲液和 N H H O 进行洗脱。结果见表 3 ， 从表 3可以看到 ， 使用低 p H 值 ( 5 0以下 ) 洗脱 液洗脱 ， 一氨基丁酸不能被洗 脱， 虽然在 p H 6 0时有少部分被洗脱， 但主要集中 在 p H值 8 0 9 0 。 1 擎 图 5 吸附流速对 吸附量 的影响 表 3 不 同 p H洗脱液对 一氨基丁酸的洗脱影响 洗脱液 p H值 收集液薄层显色 无色斑 无色斑 有微 略色斑 有明显色斑 颜色比标准品色斑深 收集 p H在 8 0 9 0之间的洗脱液 ， 每 3 m L收 集一试管 ， 分别测定其 一氨基丁酸的质量分数 ， 测 定结果表明， 在此 p H下收集到的样品中 一 氨基丁 酸的纯度均达到 7 0 以上 ， 其含量 占总含量 的 9 4 6 8 ， 已基本洗脱完全。 参考文献 1 北京医学院基础部 中枢神经介质概论 M 北京：科 学出版社，1 9 7 7： 2 1 0 2 2 8 1 2 冈田忠司 G A B A富化了胚芽生理机能 J 食品开发 ， 2 0 0 1 ， 3 6 ( 6 ) ： 7 9 3 O k a d a T ， S u g i s h i t a T， M u r a k a m i T， e t a 1 E f e c t o f d e f a t t e d r i c e Ge r m e n r i c h e d w i t h GAB A f o r d e p r e s s i o n， a u t o n o mi c d i s o r d e r b y o r a l a d m i n i s t r a t i o n J N i p p o n S h o k u h i n K a g a k u K a s h i ， 2 0 0 0， 4 7 ( 8 ) ： 5 9 6 6 0 3 4 郑红发 ， 黄亚辉 一 氨基 丁酸 的药理作 用 J 茶 叶 通讯 ， 2 0 0 4 ( 4 ) ： 1 41 7 5 津志田藤二郎 7 三酪酸 老蓄积 善世允茶 制 造匕奄 特征 J 农化，1 9 8 7 ， 6 1 ： 8 1 7 8 2 2 1 6 林智， 大森正司 一氨基丁酸茶(G a b a r o n T e a )降血 压机理的研究 J 茶叶科学， 2 0 0 1 ， 2 1 ( 2 ) ： 1 5 31 5 6 1 7 林智， 林钟鸣， 尹军峰，谭俊峰 厌氧处理对茶叶 一 氨基丁酸含量及其品质的影响 J 食品科学， 2 0 0 4 ， 2 5 ( 2 ) ： 3 5 3 9 1 8 黄亚辉 ， 郑红发 ， 曾贞 金 白龙茶 ( G A B A R O N)的研 制 及临床试验 J 茶 叶通讯 ， 2 0 0 1 ， ( 4 ) ： 3 5 1 9 黄亚辉， 郑红发，曾贞，刘霞林，雷翔剑， 彭亿海 金 白龙茶( G A B A R O N)治疗高血压临床试验报告 J 高 血压杂志 ， 2 0 0 2 ， 1 0 ( 1 ) ： 5 5 5 6 1 ” 如 0 鎏 嚣一 H 释 餐 窭 0 9 O O O O 0 3 4 5 6 8 ： = l l = = H H H H H p p p p p 维普资讯 氨基酸和生物资源 1 5 1 0 黄亚辉， 郑红发， 刘霞林 ， 王旭 G a b a r o n茶加工过程中 一 氨基丁酸和谷氨酸的动态变化研究 J 食 品科 学 2 0 0 5 ， V o 1 2 6 ( 8 ) ： 1 1 41 2 0 1 1 黄亚辉 ， 郑红发， 黄怀生， 王旭 高 y 一氨基丁酸茶游 离氨基酸的变化及机理分析 J 食品科学， 2 0 0 7 ， 2 8 ( 0 2 ) ： 5 65 9 S t u d i e s o n t h e TLC a n d Ex t r a c t i o n a n d Pur i fic a t i o n O f Ami no b u t y r i c Ac i d o f GABA Te a HUANG Yah u i ，Z HENG Ho n gf a ，HUANG Hu a i s h e n g ，Z ENG Z h e n ( 1 ， S o u t h C h i n a A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ， G u a n g z h o u 5 1 0 6 4 2 ； 2 ， Hu n a n T e a R e s e a r c h I n s t i t u t e ， C h a n g s h a 4 1 0 1 2 5 ，C h i n a ) Ab s t r a c t ： T h e t h i nl a y e r c h r o m a t o g r a p h y( T L C)a n d e x t r a c t i o n a n d p u ri f i c a t i o n o f 一a mi n o b u t y r i c a c i d o f G A B A t e a w e r e s t u d i e d T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t ： 1 一b u t a n o l ： a c e t i c a c i d ： w a t e r( 4： 1 ： 1 )w a s s u i t e d f o r t h e s e p a r a t i o n o f 一a mi n o b u t y r i c a c i d，Rf wa s 0 4 6Th e s c a n n i ng wa v e l e n g t h s we r e k S=51 5n m ， kR =6 8 0n m ，t h e l i n e a r i - t y r a n g e wa s 0 5 Ll 5 L， a n d t h e a v e r a g e r e c o v e r y r a t e wa s 98 7 5 W a t