本科论文_细脚拟青霉发酵液中清除DPPH自由基活性物质的分离和制备.doc

1 目目 录录 中文摘要2 关键词2 前言2 1 材料与方法3 1.1 材料3 1.1.1 供试菌株3 1.1.2 常用培养基3 1.1.3 显色剂3 1.1.4 主要仪器3 1.2 研究方法4 1.2.1 供试菌株液体种子的准备4 1.2.2 发酵罐培养与发酵液的处理4 1.2.3 清除自由基活性检测模型4 1.2.4 活性指导下的分离5 2.结果与分析7 2.1 活性组分的初步确定7 2.2 乙酸乙酯相活性组分的硅胶柱色谱的粗分及活性跟踪8 2.3 样品的凝胶柱色谱和活性追踪9 2.4 样品的纯度鉴定: 10 2.4.1 tlc 检 验10 2.4.2 高效液相色谱分析11 2.5 样品的活性验证12 3.讨论12 参考文献12 致谢13 英文摘要14 2 细脚拟青霉发酵液中清除细脚拟青霉发酵液中清除 dpphdpph 自由基活性物质的自由基活性物质的 分离和制备分离和制备 作者：王伟 指导老师：樊美珍 （安徽农业大学生命科学学院 2003 级生物科学二班，安徽合肥，230036） 摘要摘要: :本文对一株细脚拟青霉菌株 p6 发酵液中清除 dpph 自由基活性物质进行了研究,将发酵液选择 45减压浓缩到一定体积，采用 70乙醇醇沉去除大分子适当浓缩后用不同有机溶剂萃取处理，采用 tlc- dpph（二苯基苦基苯肼）薄层层析法和 dpph 自由基酶标仪法对发酵液及其提取物中清除 dpph 自 由基活性物质进行定性和定量检测。结果表明，在起始反应浓度为 5.0 mg/ml 时的有机萃取相中，乙酸 乙酯与三氯甲烷萃取相组分的活性最高，对 dpph 的相对清除率分别为 71.6 %，66.3 %；且与水相的抑 制率也基本互补。因此，初步判定发酵液的脂溶性活性成分主要存在于乙酸乙酯相。对乙酸乙酯相中的 活性成分进行分离、制备后，得一较纯组分 p6-01，经活性测定，在反应浓度为 0.5mg/ml 时，于 37 下保温 10min 时对 0.4mg/mldpph 自由基清除率为 78.5。 关键词：关键词：虫草 无性型 次生代谢产物 前言前言 细脚拟青霉（paecilomyces tenuipes (peck) samson）是一种世界性分布的虫生真菌，在 国内常见寄生于南方森林中鳞翅膜昆虫的蛹和幼虫，被认为是虫草的无性阶段1。由于虫 生菌与昆虫的长期协同进化关系，近年来虫生菌被认为是最有可能从中发现新型生物活性 物质的类群，有关研究受到世界各国的广泛关注2。目前对细脚拟青霉的研究主要有如下 几方面：一、单纯的生物活性研究，如苏银法等（1996）曾对该菌株的孢梗束水提物进行 了对小鼠中枢神经和免疫器官的影响试验，发现细脚拟青霉具有明显的镇静和镇痛作用4； 金丽琴等（1997,2002）曾对细脚拟青霉菌丝体水煎品对大鼠脂质过氧化物和还原型谷光甘 肽水平影响进行试验，结果表明能减少脂质过氧化物的生成，维持还原型谷光甘肽的含量； 同时发现细脚拟青霉总多糖对大鼠非特异性免疫调节作用5-6。此外，还有其水提物治疗 糖尿病的报道以及抗菌、抗疟、杀虫和细胞毒的报道(nam et al, 2001；kikuchi et al，2004) 。二、单纯的成分研究，如陈祝安和徐珊（1989）和陈召南（1992）等曾分别对细脚拟青 霉的固体培养物与天然冬虫夏草的氨基酸、甾醇类、糖醇和生物碱等成分进行过比较分析； kikuchi 等（2004）报道了一种单端孢烷和烯类骨架的新化合物 tenuipesine a 和 spirotenuipesine a 和 b 。三、活性成分的鉴定。泰国学者 nilanonta 等（2002）曾通过特 殊培养方式从中发现了具抗菌、杀虫活性的 beauvericin a 和 b、allobeauvericin a、b 和 c11；另外，nam 等（2001）还报道了两种细胞毒成分：acetoxyscripenediol 和一种麦角 甾醇过氧化物12。 3 虽然对细脚拟青霉的相关研究已有较多的报道，但还未见其清除二苯代苦味肼基自由 基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl, dpph）活性系统研究的详细报道。现代医学研究表明， 人体内很多疾病都与机体内的自由基有着密切的关系，对自由基方面的研究已经成为医药 学界研究热点13。本实验室在一次大规模的生物活性物质筛选中发现一株细脚拟青霉 p6 的发酵物具有较强的清除自由基活性。为了进一步确定该菌株株发酵液提取物的清除自由 基活性，本研究将分别对摇瓶发酵液和其提取物进行清除 dpph 自由基研究，为进一步的 结构研究和相关药物的开发提供理论依据。 1 材料与方法 1.11.1 材料材料 1.1.11.1.1 供试菌株供试菌株 实验所用菌株均由安徽农业大学微生物防治省级重点实验室提供。 1.1.21.1.2 常用培养基常用培养基 固体斜面培养基(sday)：蛋白胨 10 g/l、酵母浸出粉 10 g/l、葡萄糖 40 g/l、琼脂 20 g/l，以蒸馏水定容。 固体斜面培养基(pda)：马铃薯 200 g/l （去皮，切成小块煮沸 20min，纱布过虑） ， 葡萄糖 20 g/l，琼脂 20 g/l，以蒸馏水定容。 液体摇瓶培养基（sdy）：蛋白胨 10 g/l、酵母浸出粉 10 g/l、葡萄糖 40 g/l、 ph6.7，以蒸馏水定容。 固体平皿培养基(sday)：蛋白胨 10 g/l、酵母浸膏 10 g/l、葡萄糖 40 g/l、琼脂 20 g/l，以蒸馏水定容。 深层液体发酵罐发酵培养基：蛋白胨 1.0 %、酵母粉 1.0 %、白砂糖 4.0 %。或黄豆粉 3%、酵母粉 1.0 %、白砂糖 2.0 %。 1.1.31.1.3 显色剂显色剂 碘试剂：在密闭的玻璃缸内将少许碘结晶或将少许碘结晶与适量的 75150 m 硅胶 搅拌均匀，显色时，将点过样品薄层板放入碘缸内即可。 15 %硫酸乙醇溶液：取浓硫酸 120ml 沿瓶壁缓慢的加入到盛有无水乙醇（分析纯）780 ml 的广口瓶中，同时不断地搅拌，盖上瓶盖备用。显色时，将点过样品的薄层板用镊子直 接浸入其中，取出淋干后放置电炉上小火慢慢烘烤或放在电热板上烘烤到呈现明显的斑点 即可。 1.1.41.1.4 主要仪器主要仪器 本研究使用的具体仪器及型号见下表。 表表 1 1 主要仪器及其型号主要仪器及其型号 tabletable 1 1 mainmain equipmentsequipments andand theirtheir typestypes 仪器名称 name规格型号 type生产厂家 manufactory 4 hplcsp930d, uv730d韩国 younglin 公司 全波长扫描酶标仪spectra max m2美国 molecular device 公司 系列色谱柱玻璃柱中国科技大学玻璃仪器厂 自动收集仪bsz-100上海沪西分析仪器厂 高效薄层硅胶板 gf254分析型（铝基和玻璃基）德国 merck 公司和青岛海洋化工厂 高效薄层硅胶板 gf254制备型（玻璃基）安徽岳西硅源材料厂 光照培养箱lrh-250-g广东省医疗器械厂 手提式压力蒸汽灭菌器yxq.sg4.280上海华线医用核子仪器有限公司 全温振荡培养箱hzq-f 160哈尔滨东联电子公司 30l 发酵罐gy-70c江苏理工大学 电热蒸汽发生器dzfz上海佳田制造有限公司 电热恒温培养箱hh-b11-560上海跃进医疗器械公司 数码显微镜vhx-100日本 keyence 公司 高速分散器pt3100瑞士 polytron 酸度计818美国 orion 公司 三用紫外分析仪wfh-203b上海精科实业有限公司 真空旋转蒸发仪senco r-502b上海申胜生物技术有限公司 超净工作台air tech苏净集团安泰公司 数控超声波清洗器kh5200昆山禾创超声仪器公司 冷冻干燥系统040520111g美国 labconco 公司 超速离心机2k15美国 sigma 公司 管式离心机gq105上海市离心机械研究所 高速冷冻离心机tl15江苏图门离心机厂 梅特勒电子天平ae200 型上海分析仪器厂 循环水式真空泵shz-d河南巩义英豫华仪器厂 超低温冰箱mdf-382e日本三洋公司 1.21.2 研究方法研究方法 1.2.11.2.1 供试菌株液体种子的准备供试菌株液体种子的准备 将供试菌株 p6 的固体种子分别接种至液体摇瓶培养基，液体培养时装液量为 200 ml500 ml，接种量控制在 5，接种后置于全温振荡培养箱，温度 25、转速 180 rpm，培养 7d 备用。 1.2.21.2.2 发酵罐培养与发酵液的处理发酵罐培养与发酵液的处理 采用 30l 发酵罐进行发酵，初始装液量 20l，接种量 10 %，通气量 1:1（v/v） ，以枣 庄市峄城厂生产的食用消泡剂进行消泡，25恒温通气培养 10d 出罐。采用管式离心机进 行发酵液和菌丝体分离；将获得的发酵液用低温真空浓缩法进行浓缩处理，浓缩至原体积 的 1/10，后加入浓度为 95%乙醇使发酵液中的乙醇浓度含量达到 70%。过夜，再用布氏漏 斗真空抽滤法去除生物大分子（多糖和蛋白） 。取出上清液进行浓缩，冷冻干燥，冻干粉备 用；菌丝体采用 50 热干燥法烘干保存备用。 1.2.31.2.3 清除自由基活性检测模型清除自由基活性检测模型 1.2.3.11.2.3.1 供试样品的准备供试样品的准备 5 电子天平准确的称取上述供试菌株发酵液冻干粉 1g，用乙酸乙酯 10ml，于 100hz 超声波中提取 30 min。离心吸取上清液并吹干称重，溶于甲醇溶液，配成 浓度为 10.0 mg/ml 作为初试样品 1.2.3.21.2.3.2 清除自由基活性物质定性检测清除自由基活性物质定性检测 取浓度为 10 mg/ml 上述提取物的甲醇溶液进行 dpph 自由基薄层试验，以 1.0 mg/ml 的抗坏血酸甲醇溶液为阳性对照。点样量为 4l，展开剂为氯仿:甲醇= 80:20。等流动相 到达距上沿 1cm 的地方，取出让展开剂自然挥去，然后喷浓度为 1 mg/ml 的 dpph 自由基 95乙醇溶液进行显色，并用铅笔轻轻的划下活性点。 1.2.3.31.2.3.3 清除自由基活性物质的定量测定清除自由基活性物质的定量测定 参考胡丰林和陆瑞利（2004）的 dpph 自由基酶标仪法。加各浓度样品 100l 和事先 用 95乙醇配好的 0.4 mg/ml 的 dpph 自由基试剂 100l 于 96 孔酶标板中，每个样品设 三个重复。样品加入后将 96 孔酶标板置于酶标仪中振动 30 s，在 37和 517 nm 波长下测 定其吸光值（ap） ；37保温 10min 后再测定一次。同时测定不加 dpph 自由基试剂的样品 空白吸光值(ac)和加 dpph 自由基试剂但不加样品（100l 80甲醇代替样品）的吸光值 （amax） 。最后按下述公式计算： 相对清除率（）=1-（ap-ac）/amax100 1.2.41.2.4 活性指导下的分离活性指导下的分离 活性提取物的确定：将筛选出的活性菌株发酵液冻干品分别用石油醚、乙酸乙酯、甲 醇和水等试剂浸提。提取物经低温真空浓缩冻干后，用适当的溶剂配成一定浓度的溶液， 用 dpph 活性测定模型进行活性测定，找出活性提取物以进行进一步的分离纯化。 1.2.4.11.2.4.1 薄层层析（薄层层析（tltlc） 薄层层析（thin-layer chromatography，简称 tlc）是在吸附层析的基础上发展起来 的，目前已广泛应用于定性和定量分析、分离、纯化、制备目的，它的作用机理主要包括 吸附、分配、离子交换等作用。 按照相似相溶规律，极性组分易溶于极性溶剂，非极性组分则易溶于非极性溶剂中， 因此在同一薄板上，不同极性化合物的组分在同一溶剂中的溶解度不同，溶解度愈大，移 动速度愈快；反之则相反。展层的过程即样品各组分得到分离的过程，它也是一个吸附， 解析，再吸附，再解析的连续过程。 薄层层析的定性分析与纸层析类似，对组分简单样品的定性，可根据在同一薄层板上， 样品组分的 rf值和标准样品的 rf值对照；对于复杂样品的定性，需数种方法才能确定；薄 层层析后，样品组分的定量分析有洗脱测定法和原位法。 试验方法：用毛细管吸取样品点到已活化的 gf254高效薄层层析硅胶板上，点的直径在 2 3 mm，距薄层一端距离为 1cm 左右，各样品点之间的距离一般也控制在 1cm 左右。将硅 胶板放入已饱和的层析槽中展开，当展开溶剂上行到距硅胶板另一端 1cm 处时，取出硅胶 6 板，待溶剂挥发干后于紫外灯下观察结果并用铅笔在有样品的地方圈出，同时碘染显色和 10%浓硫酸中显色，主要用于对过层析柱后的样品的合并以及对分离得到的单体进行鉴定。 1.2.4.21.2.4.2 硅胶柱层析硅胶柱层析( (采用湿法装柱干法上样法采用湿法装柱干法上样法) ) 洗脱剂极性的选择及起始装柱溶剂的选择：采用薄层色谱法对洗脱剂极性和起始装柱 溶剂进行选择。洗脱剂一般多用混合溶剂，但起始溶剂的选择原则就以开始的纯溶剂为展 开剂对样品展开，点或利用 tlc 色谱选择样品保留在点样刚刚出头的溶剂为装柱的溶剂， 然后通过比例的调节，按照由极性小逐渐过渡到极性大的洗脱剂为原则（正向层析） ，从而 达到分离物质的目的。由于薄层色谱的固定相是干燥的，干燥硅胶的吸附活性是一般湿法 装柱的硅胶吸附活性的 2 倍。因此，洗脱剂的极性选择原则采用最大极性展开剂使样品在 薄层板上的 rf值在 1/2 以下为宜。 装柱：首先将适量洗脱剂倒入柱内，排走其中的空气，然后把预先用洗脱剂浸泡好的 硅胶（硅胶的用量约为样品量的 3050 倍）搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱（硅胶柱色 谱规格 4.040cm）中，待其自然沉降至柱高的 1/41/3 时打开柱下端的阀门，让溶剂缓 慢流出，硅胶沉降时，轻轻振动层析柱外壁，使硅胶沉降均匀，直至硅胶沉降完全，关闭 阀门。 拌样：将浓缩后的样品充分溶解于少量的有机溶剂中，与适量的粗硅胶(h60)搅拌均匀， 挥发干溶剂后，得到柱层析所需样品。 上样：打开柱下端的阀门，当柱上端溶液流到与固定相表面一致的位置时将经拌样得 到的样品在柱面上铺匀，再加入少量起始洗脱剂，使样品慢慢润湿，等样品完全润湿后， 加入洗脱剂，打开阀门，收集洗脱液。 洗脱与收集：选择适当的洗脱剂，按极性从小到大的顺序，选择不同的梯度（每个梯 度 12 个柱体积）连续洗脱，分管收集洗脱液。 1.2.4.31.2.4.3 凝胶柱层析凝胶柱层析 采用 151000 mm 的羟丙基葡聚糖（lh-20）柱： 装柱：先将 sephadexlh-20 在甲醇中充分的溶涨过夜。溶涨好后用干净的吸管把上清 悬浮的颗粒凝胶吸去，然后倒入事先准备好的玻璃柱中，装柱时上缓倒,下慢放，要一次 完成（in one pour） 。装柱操作中注意不要剧烈搅拌，以防颗粒碎裂；操作要均匀，以免 柱中形成紧实的界面；振动有利于提高柱质量。让其自然沉降至胶平面不在下降为止 （12-24 h） ，为加速沉降可同时进行以 1-5 ml/min 的甲醇进行柱子平衡。 上样：上样体积控制在 15 %。先放掉柱上过多的流动相，等液面刚好接近胶平面 时关掉放液阀，用吸管吸取样品沿柱壁缓慢的加入待分样品后，打开放液阀，使加入的样 品进入胶内后关闭阀门，再用甲醇洗剩下的样品，打开放液阀使样品进入胶内后，再吸取 流动相甲醇沿柱壁慢慢加入，调整柱流速控制在 2-3 滴/min，准备收集。 收集：调整好流速后用自动收集仪进行收集，每管控制收集 5 ml。收集到的各个组 7 分用旋转蒸发仪 42 左右减压浓缩，然后用 tlc 或 hplc 进行分析。同时进行活性测定。 活性部分将用 hplc 等方法进一步纯化。 1.2.4.41.2.4.4 高效液相色谱法 样品前处理：所有的样品都必须澄清透明，并尽可能溶于水或甲醇中。 流动相：主要是水和甲醇或水和乙腈进行等度洗脱或分段梯度洗脱，具体配比要根据 hplc 的分析结果来定；洗脱速度：一般为 15-20 ml/min。 色谱柱：使用 wters 19250 mm, 10 m, ods2。 检测条件：根据目标成分的紫外光谱特性选择适当的检测波长。常用 254 nm 或 210 nm 等波长检测。 主要分离纯化工艺流程如下：主要分离纯化工艺流程如下： 2.2.结果与分析结果与分析 2.12.1 活性组分的初步确定活性组分的初步确定 为了选择最佳萃取试剂， 选取 4 种有机溶剂：石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇进行 萃取，将所得有机相和水相分别浓缩至干，称重，以甲醇为溶剂，分别配制成反应浓度为 5.0mg/ml 的供试样品，按前述方法进行活性测定。结果见表 2。 表表 2 2 不同有机溶剂提取物对清除不同有机溶剂提取物对清除 dpphdpph 活性的影响活性的影响 table2table2 effecteffect ofof differentdifferent extractingextracting solventsolvent onon dpphdpph freefree radicalradical scavengingscavenging activityactivity 样品反应浓度（5mg/ml）dpph 的相对清除率（%） 发酵液的脂溶相（乙酸乙酯相） 凝胶层析柱（sephadexlh-20）/高效液相色谱（hplc） tlc-dpph 自由基清除活性检测，合并相同组分 硅胶柱色谱初步分离 纯度鉴定 发 酵 醪 液 活 性 验 证 8 石油醚相 5 19.60.02 石油醚萃取后的水相 5 80.10.21 三氯甲烷相 5 66.30.14 三氯甲烷萃取后的水相 5 32.90.04 乙酸乙酯相 5 71.60.24 乙酸乙酯萃取后的水相 5 27.50.036 甲醇相 5 58.10.007 甲醇萃取后的水相 5 41.50.009 由表 2 中结果可以看出，起始反应浓度同为 5.0 mg/ml 时，在有机萃取相中，乙酸乙 酯与三氯甲烷萃取相组分的活性最高，对 dpph 的相对清除率分别为 71.6 %，66.3 %；且 与水相的抑制率也基本互补。因此，初步判定发酵液的脂溶性活性成分主要存在于乙酸乙 酯相。 2.2 乙酸乙酯相活性组分的硅胶柱色谱的粗分及活性跟踪 将 8.5g 浸膏加入适量的甲醇充分溶解后，适量硅胶拌样，减压浓缩至干，加到常压硅 胶柱中进行粗分.具体洗脱梯度如表 3 表表 3 3 流动相梯度表流动相梯度表 table3 different proportion of ambulatory organic impregnant 上样后，逐管收集洗脱液，每管收集 100ml。于同一块硅胶板上，将收集的各管洗脱 液分别点样 50l，挥干溶剂后，然后喷浓度为 1 mg/ml 的 dpph 自由基 95乙醇溶液进行 洗脱剂比例体积(ml) 三氯甲烷/500 三氯甲烷甲醇99:1500 三氯甲烷甲醇98:2500 三氯甲烷甲醇97:3500 三氯甲烷甲醇95:5500 三氯甲烷甲醇9:1500 三氯甲烷甲醇8:2500 三氯甲烷甲醇7:3500 三氯甲烷甲醇6:4500 三氯甲烷甲醇5:5500 三氯甲烷甲醇4:6500 三氯甲烷甲醇3:7500 三氯甲烷甲醇2:8500 三氯甲烷甲醇1:9500 甲醇/500 ac 9 显色。30 分钟数码相机拍照记录。结果如图 1 所示 从图 可看到 p6 发酵液乙酸乙酯提取物，经硅胶柱分离后的流分中 22、26、27、28、32、33、38、39、40、41、42、43、44、45 和 46 号收集物都有较强的 清除 dpph 自由基活性。本研究选择有活性部分收集物进一步进行 tlc 试验，合并相同组分。 经过进一步 tlc 试验结果发现收集物，成份相似，且成分相对较少。结果如图 2 所示 。合 并 39 至 46 管收集物，减压浓缩后得样品50，将样品进行进一步的分离制备和活性 研究。 图图 1 1-66 的的 tlc 分析分析 fig 1 tlc analysis of components1-66 图图 2 39-46 的的 tlc 分析分析 fig 2 tlc analysis of components 39-46 2.3 样品样品的凝胶柱色谱和活性追踪的凝胶柱色谱和活性追踪 10 首先将 20mg 样品充分溶于甲醇中，然后放掉柱上过多的流动相，等液面刚好接近 胶平面时关掉放液阀，用吸管吸取样品沿柱壁缓慢的加入样品后，打开放液阀，使加入 的样品进入胶内后关闭阀门，再用甲醇洗剩下的样品，打开放液阀使样品进入胶内后，再 吸取流动相甲醇沿柱壁慢慢加入，调整柱流速控制在 2-3 滴/min，每管收集 10ml。 于同一块硅胶板上，将收集的各管洗脱液分别点样 20l，挥干溶剂后，然后喷浓度为 1 mg/ml 的 dpph 自由基 95乙醇溶液进行显色。30 分钟数码相机拍照记录。结果如图 3 所示 图图 3 样品的样品的 tlc 分析分析 fig 3 tlc analysis of samples 由图 3 可以看出 44 号样品黄色斑点最明显说明其清除 dpph 自由基最强。其次， 52、53、54、55、56 和 57 号也具有相对较强的清除 dpph 自由基活性。 下面将仅对有活 性的收集物逐管进行 tlc 试验，近一步的进行纯度鉴定和活性追踪。 2.42.4 样品的纯度鉴定样品的纯度鉴定 2.4.12.4.1 tlctlc 检验检验 采用 tlc 检验，选择展开剂及配比主要为乙酸乙酯:甲醇6:1；氯仿:甲醇5:1 进行检验，结果发现仅 44 号管收集物为一纯品。纯度鉴定如图 7 所示： 11 从上述的两种展开剂展开的结果，初步判定 44 号收集物为单一化合物，命名为 p6- 01。图 7 中 1 和 2 分别为化合物 p6-01 在展开剂和中展开后碘蒸汽显色的情况，10%浓 硫酸乙醇 p6-1 显紫色为图 7 中 3 2.4.22.4.2 高效液相色谱分析高效液相色谱分析 色谱条件：色谱柱为 wters 19250 mm, 10 m, ods2；洗脱梯度为甲醇从 0100； 洗脱时间为 50 分钟；进样量为 20l。检测波长为 260nm、210nm 试样分别为(1)p6 培养 液提取物(1omgml 甲醇)；(2)p6-01(25mgml 甲醇)。结果见图 6 和图 7： 图图 6 6 p6p6发酵液提取物的发酵液提取物的hplchplc图图 figfig 6 6 hplchplc chromatogramchromatogram ofof thethe extractextract 1 2 3 图图 4 4 p6-01p6-01 tlctlc 图谱图谱 fig4 the tlc picture of p6-01 12 图图 7 7 化合物化合物p6-01p6-01的的hplchplc图图 figfig 7 7 hplchplc chromotogramchromotogram ofof compoundcompound p6-01p6-01 hplc 分析结果显示；(1)p6-01 在不同检测渡长下都仅有一个单峰，并且光谱特征一致， 说明 p6-01 在该检测条件下为一纯物质 (2)化合物 p6-01 的保留时间与其在原提取物中的 保留时间基本一致，说明分离制备过程中该化合物的色谱特性没变 2.52.5 样品的活性验证样品的活性验证 参照 1.2.3 的方法对样品 p6-01 进行活性验证，dpph-tlc 图谱如图 8 所示。另外， p6-01 在浓度为 0.5 mg/ml 于 37下保温 10min 时对 0.4mg/ml dpph 自由基清除率为 78.5%。 图图 8 8 p6-01p6-01 dpphdpph 试验试验 tlctlc 谱图谱图 fig 8 dpph-tlc assay of p6-01 3.3.讨论与结论讨论与结论 细脚拟青霉被认为是高雄山虫草的无性型，具有多种药理作用。目前，细脚拟青霉的 相关研究已有较多的报道，但还未见其清除 dpph 自由基活性物质系统研究的详细报道。 本文采用 tlc-dpph 法对发酵液中的清除 dpph 自由基活性物质进行定性分析，采用 dpph 自由基酶标仪法进行定量检测，并经过反复硅胶柱和凝胶柱分离、制备后，得一组分 p6- 01。经 tlc 法和 hplc 分析，初步鉴定 p6-01 为一纯品，进一步活性验证，结果表明，p6- 01 在反应浓度为 0.5mg/ml 时，于 37下保温 10min 时对 0.4mg/mldpph 自由基清除率为 78.5。这表明本试验采用的方法对于试验菌株 p6 的发酵液中清除 dpph 自由基活性物质 的分离、制备及纯度、活性验证的发方法是可行的。 参考文献 1 蒲蛰龙,李增智（主编）,1996. 合肥: 昆虫真菌学. 安徽科学技术出版社. 193 2 梁宗琦, 2001.我国虫草属真菌研究开发的现状及思考,食用菌学报.8（2）：5362 3 胡丰林,陆瑞利,2004.蔷薇科一些植物鲜叶提取物清除 dpph 自由基活性的研究.植物学 通报,21(1):7478 4 苏银法,徐珊,吴真列, 1996. 细脚拟青霉对 cns 和免疫器官重量的影响.中医药研究, 13 3:5051 5 金丽琴,吕建新,胡云良,楼永良,1997.细脚拟青霉对大鼠脂质过氧化物和还原型谷光甘肽 水平的影响.中国病理生理杂志,13(4):379382 6 金丽琴,吕建新,袁谦, 2002. 细脚拟青霉总多糖对大鼠非特异性免疫调节作用.科技通报, 18(4):276280 7 kikuchi h, miyagawa y, sahashi y, inatomi s, haganuma a, nakahata n, oshima y, 2004. novel spirocyclic trichothecanes, spirotenuipesine a and b, isolated from entomopathogenic fungus, paecilomyces tenuipes. j org chem, 69(2): 352356 8 nam ks, jo ys, kim yh, hyun jw, kim hw , 2001. cytotoxic activities of acetoxyscripenediol and ergosterol peroxide from paecilomyces tenuipes . life science, 69 (2): 229237 9 陈召南, 1992. 细脚拟青霉与冬虫夏草化学成分的初步比较.中成药, 19(2):3637 10 陈祝安,徐珊, 1989. 细脚拟青霉培养性状和药理作用的初步研究.真菌学报, 8(3): 214220 11 nilanonta c., isaka m, kittakoop p, s.trakulnaleamsai, m.tanticharoen, y.thebtaranonth, 2002. precursor-directed biosynthesis of beauvericin analogs by the insect pathogenic fungus paecilomyces tenuipes bcc1614. tetrahedron, 58: 33553360 12 nam ks, jo ys, kim yh, hyun jw, kim hw , 2001. cytotoxic activities of acetoxyscripenediol and ergosterol peroxide from paecilomyces tenuipes . life science, 69 (2): 229237 13 kikuchi h, miyagawa y, nakamura k, sahashi y, inatomi s, oshima y, 2004. a novel carbon skeletal trichothecane, tenuipesine a, isolated from an entomopathogenic fungus, paecilomyces tenuipes. org lett, 6(24): 45314533. 致谢致谢 本实验是在樊美珍教授及陈安徽博士研究生的悉心指导下完成的。从论文的选题，每 一步的实验设计，到实验的具体操作，直至论文的最后审阅，都倾注了指导老师的心血。 在此衷心感谢樊美珍教授及陈安徽师兄对我的精心指导。同时，在实验过程中，还得到了 实验室各位老师和师兄师姐的热心帮助，在此一并向他们表示感谢！另外，向四年来为我 14 提供了良好的学习环境的生命科学学院的各位领导和老师表示诚挚的谢意！ 值此论文完成之际，向所有关心和支持本项研究的老师和同学表示衷心的感谢，同时 向参加论文评阅和答辩的专家教授致以衷心的感谢和崇高的敬意。 isolation and preparation of dpph free adical scavenging active compounds in the fermentation broth of paecilomyces tenuipes author: wang wei director: professor fan mei-zhen (college of life sciences, anhui agriculture university, hefei 230036) abstract: the isolation and preparation of dpph free radical scavenging active compounds in the fermentation broth of a strain of paecilomyces tenuipes p6 was studied in this text. treat the fermentation broth with concentrating under 45、depositing by ethanol to wipe off macromolecule and extract by organic solvent before we detecting the dpph free radical scavenging active compounds in the fermentation broth. the results revealed that the ethyl acetate extracts got the strongest free radical scavenging activity, the rate of dpph free radical scavenging can reach 71.6%. it can confirm that the fatsoluble active constituents are mainly exist in the ethyl acetate extracts. a pure constituent p6-01can get after isolating by silicagel column and gelcolumn, and at the concentration of 0.5mg/ml it can decrease 78.5 percent 0.4mgml dpph radicals after incubated at 37 for 10 minutes. key words： paecilomyces tenuipes active compounds isolashion preparation ut2apodfxxc02gybkskcww97mrqqwhoj5tl15zt6jipyytycummtarp3v1n5luizi3xh3bhwyreko8d9g7nmzqowpjetldrw08gvs8dsdqqygc3ce7moo2tlf0jf1gk74iuxybmtivr97ckrfvqult5fn2t6mpjr6rbzvpsortzvij5nb5ndvvsr4iwr1twlfkglspzuhrjq3cmzu98euouijdlszqpmvrw9zkupxf8wfug9l2g9277g2rtipa1ypczeuqxpkbhtvdcooqozxuz3vjrzmocijym62zchmeootyes8ebmm932tbz2yo09rtszeys8zrd2yktj8l6jeazvajnfbtrylvsm6ofbftoxvrffn7owiygjlamkunxjybz5rrb7r4vsur9zpfzfmfsjhcfca37lnw2vvlrkn7r8psz1bn6oric5hu5z6hcxayqynpog8duybawqsl