碱提酸沉法提取红松仁分离蛋白的工艺研究.pdf

第 2 0卷 2 0 0 8 年 第 6期 l 2月 黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报 J 0 u ma 1 0 f He i l o n i a n g Au g u s t F j r s t L a J 1 d Re c l a ma t i o n Un i v e r s i t y 2 0 ( 6 ) ： 7 l 7 4 De c 2 0 0 8 文章编号 ： 1 0 o 2 2 0 9 0 ( 2 0 o 8 ) O 6 0 0 7 1 一 o 4 碱提酸沉法提取红松仁分离蛋白的工艺研究 王振字 一 ， 杨丽娜 ， 李宏菊 ( 1 东北林业大学林学院， 哈尔滨 l 5 O 0 4 O ； 2 哈尔滨工业大学食品学院) 摘要： 采用碱提酸沉法提取红松仁分离蛋白， 选择 p H值、 浸提时间、 料液比和温度作为单因素进行试验， 再通过 L 9 ( 3 ) 正交 试验确定最佳提取条件， 得到红松仁分离蛋白提取的最佳条件为 p H 9 0 、 浸提时间 6 0 m i n 、 料液比 1 ： 2 5 、 温度 3 5 。 在最佳提取 工艺条件下红松仁分离蛋白的提取率可达 6 1 0 3 。 关键词 ： 红松仁； 分离蛋白质； 提取 中图分类号 ： 2 5 5 6 文献标识码： A St ud y O n Te c hn O l o g y O f S e p a r a t i n g Pr O t e i n f lr O m Pi n e Nut b y Al ka l i Ex t r a c t i 0 n a nd Ac i d Pr e c i pi t a t i O W a n g Z h e y u l 2 ， Ya n g L i I l a ， L i H0 n g j u ( 1 N o r t h e a s t f 0 r e s t r y U n i v e r s i t y H a r b i n 1 5 0 O 4 0 ； 2 D e p a r t m e n t o f F b o d S c i e n c e a n d I 1e c h n o l 0 g y ， H a r b i n I n d u s t r y U n i v e r s i t Ab s t r a c t ：Al k a 1 i Ex t r a c t i o n a n d Ac i d P r e c i p i t a t i o we r e u s e d t o e x t r a c t s e p a mt i o n p r 0 t e i n f _r 0 m p i n e n u t T h e e f f e c t s o f f o u r f la c t o r s s u c h a s t h e p H v a l u e ， e x t r a c t i o n t i m e ， s o l i d l i q u i d mt i o a n d t e m p e mt u r e w e r e i n v e s t i g a t e d Wi t h t l l e o r t h o g 0 n a l d e s i g n 0 f ( 3 ) ， t h e 0 p t i mu m c o n d i t i o n s o f e x t r a c t i o n we r e 0 b t a i n e d a s f 0 l l o w s ： p H v a 1 u e wa s 9 O ， e x t r a c t i o n t i me wa s 6 0 mi n ， s o l i d l i q u i d r a t i o wa s 1 ： 2 5， t e mp e r a t u I le wa s 3 5 Un d e r t h i s c o n d i t i o n ， t h e s e p a mt e d p r o t e i n y i e l d wa s 6 1 0 3 K e y w 0 r d s ： p i n e n u t ； s e p a r a t e d p I D t e i n ； e x t r a c t i o n 红松( P i n u s k o n a i e n s i s S i e b e t z u c c 1 属松科植物 ， 是一种经济价值很高的树种，它是我国的珍贵树种之 一 。我国东北地区是其 自然分布的中心地带。 红松 籽是红松所结的种子， 其种仁中含有较高的蛋白质， 含量在 1 3 2 O ， 富含 1 8 种氨基酸， 而且人体必需 的 8 种氨基酸与国际卫生组织( wH O ) 和联合国粮农 组织f F A O ) 规定的氨基酸人体必需量标准值基本相 符【3 J。红松仁分离蛋白具有诱人食欲的香味， 可制成 多种多样的美味食品 ， 如松仁乳饮料 、 松仁香肠 、 松 仁酱、 松仁汉堡和松仁冷饮等多种特色食品【4 l5 J。 但 目 前国内外对红松仁分离蛋白研究报道甚少，市场上 松仁产品也十分少见 。因此 ， 本试验对红松仁分离蛋 白提取进行了研究，以期为松仁分离蛋白的实际生 产提供理论依据和研究基础。 l 材料与方 法 1 1 材料与仪器 红松籽 ， 产于黑龙江省伊春市 。 盐酸 、 氢氧化钠 、 无水 乙醇 、 磷 酸 、 硼酸 、 硫酸铜 、 甲基红、 硫酸钾、 过氧化氢和浓硫酸均为分析纯， 考 马斯亮蓝 G 一 2 5 O ， 上海绿鸟科技发展公司产品。 T G L l 6 C高速台式离心机，上海安亨科学仪器 厂； 凯氏定氮装置； 7 2 2 s 可见光分光光度计 ， 上海精 密科学仪器有限公司； H H s电热恒温水浴锅 ， 上海博 迅实业有限公司医疗设备厂； A L c l 1 O 4电子天平 ， 北京赛多利斯仪器系统有限公司； 8 5 2 磁力搅拌器， 上海浦东物理光学仪器厂； P H s 一 3 c P H计， 上海伟业 仪器厂； F D l 型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器 收稿日期： 2 0 0 8 1 2 一 O 2 作者简介： 王振宇( 1 9 5 7 一 ) ， 男 ， 教授， 哈尔滨工业大学毕业 ， 现主要从事食品生物反应工程的教学与科研工作。 7 2 黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报 第 2 0卷 有限公司。 1 2 试验方法 1 2 1 分 离蛋 白的提 取 工艺流程 红松籽一去壳一去红衣一干燥一粉碎( 6 0目) 一 超临界 c O ： 萃取脱脂一脱脂松仁粉一搅拌浸提 离 心一取上清液一调 p H值至等电点一离心 取沉 淀一调p H值至 7 0 一真空冻干一成品。 1 2 2 单因素试验 ( 1 ) p H值对红松仁分离蛋白提取率的影响 准确称取 l 0 g 脱脂松仁粉 5 份。将脱脂松仁粉 与水以 l ：2 0的比例混合后 ， 移人电子恒温水浴锅， 用 O 1 M的 N a 0 H溶液调混合液的 p H值 ，分别为 7 0 、 8 0 、 9 0 、 l 0 0 、 1 1 0 ， 在 4 0下 ， 浸提 5 0 mi n ， 浸提 时 维持 p H恒定( O 1 ) 。研究 p H值对红松仁分离蛋白 提取率的影响。 ( 2 ) 提取时间对红松仁分离蛋 白提取率的影响 准确称取 l 0 g 脱脂松仁粉 7 份。将脱脂松仁粉 与水以 1 ： 2 0 的比例混合后， 移人电子恒温水浴锅， 用 0 1 M 的 N a O H溶液调混合液的 p H值为 9 0 ， 在 4 0下 ，分别浸提 2 0 、 3 0 、 4 O 、 5 0 、 6 0 、 7 0 、 8 0 m i n ， 浸 提时维持 p H恒定( 0 1 ) 。 研究提取时间对红松仁分 离蛋白提取率的影响。 ( 3 ) 料液比对红松仁分离蛋白提取率的影响 准确称取 l 0 g 脱脂松仁粉 6 份。将脱脂松仁粉 与水分别 以 1 ： 5 、 l ： l 0 、 1 ： 1 5 、 1 ： 2 0 、 l ： 2 5 、 1 ： 3 0的比例混 合后 ， 移入电子恒温水浴锅 ， 用 0 1 M 的 N a 0 H溶液 调混合液的p H值为 9 0 ， 在 4 0 下， 浸提 6 O m i n ， 浸 提时维持 p H恒定( 0 1 ) 。 研究料液比对红松仁分离 蛋白提取率的影响。 ( 4 ) 温度对红松仁分离蛋白提取率的影响 准确称取 1 O g J搠 6 份。 与水 以 1 ：2 5 的比例混合后， 移入电子恒温水浴锅， 用 Q l M的 N a O H溶液调混合液的p H值为9 -0 ，分别在 2 5 、 3 O 、 3 5 、 4 0 、 4 5 、 5 O下， 浸提 6 O mi n ， 浸提时维持 p H恒定( 0 1 ) 。 研究温度对红松仁分离蛋白提取率的影响。 1 2 3 正 交试验 在单因素试验基础上，确定上述四因素的上下 水平临界限 ， 按照 ( 3 ) 正交表进行正交试验 ， 确定 最佳提取工艺。 1 3 取样及测定 l - 3 1 标准曲线的制作 准确称取 l 0 0 m g 牛血清蛋白于 1 0 0 m L容量瓶 中，加水至刻度，分别吸取 0 、 0 0 2 、 0 0 4 、 0 0 6 、 0 0 8 、 O 1 0 m L ， 加蒸馏水至 1 0 0 mL ， 然后加入 5 mL考马 斯亮蓝 G一 2 5 0试剂 ， 摇匀 ， 放 置 2 m i n后在 5 9 5 n m 波长下测定溶液的吸光值 。 以牛血清蛋 白质量浓度 ( g m L ) 为横坐标， 溶液吸光值为纵坐标， 绘制标 准曲线。 1 3 2 取 样 测定 吸取离心后的松仁蛋白提取液 0 1 m L ，定容至 5 0 mL 。取定容液 0 1 mL ， 按上述操作步骤测定吸光 值， 以标准曲线回归方程计算蛋白质含量。 1 3 _ 3 测定 方法 脱脂松仁粉中蛋白质含量测定采用凯氏定氮 法； 提取液中蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法。 1 3 4蛋 白质提取率的计算公式 蛋 白 质 提 取 率 = 需 鞋 鎏 0 0 2 结果与分析 2 1 单因素试验 2 1 1 考马斯亮蓝法测定蛋白质的标准曲线 按 1 - 3 1 所述方法进行实验， 结果经处理后 ， 得标 准曲线的回归方程为 ： y = 0 O 0 6 5 + O 0 0 1 ( 尺 = 0 9 9 8 8 ) 。 2 1 2 p H值对红松仁分离蛋 白提取率的影响 按照 1 2 2中( 1 ) 所述方法进行操作 ， 试验结果 如图 1 所示。 6 0 55 5 0 篓4 s 40 3 5 3 0 6 7 8 9 1 0 l 1 1 2 p H 值 图 1 p H值对红松仁分离蛋白提取率的影响 ng 1 Ef f e c t s o f P H v a l u e 0 n e x t mc t i 0 n r a t i 0 从图 1 可以看出， 红松仁分离蛋白随着 p H值的 升高， 提取率先升高后降低。 当p H值在 7 0 9 0的范 围， 随着 p H的升高， 红松仁分离蛋白的提取率逐渐 升高。 当 p H = 9 0时 ， 提取率达到最大， 为 5 2 4 。 这是 因为在碱性环境中红松仁分离蛋白带负电荷，蛋白 质分子间相互排斥， 使溶液分散性、 溶解性好， 提高 了蛋白的提取率。此外， 碱液对蛋白质分子的次级键 第 6期 王振宇等： 碱提酸沉法提取红松仁分离蛋白的工艺研究 有破坏作用 ， 使蛋白质分子表面具有相同的电荷， 对 蛋白质分子也起到了增溶的作用。当 p H值大予9 O 时， 由于蛋白质过度水解 ， 导致了蛋白提取率反而有 所下降。 2 1 - 3提取 时间对红松仁分 离蛋 白提取 率的影响 按照 1 2 2中( 2 ) 所述方法进行操作 ， 试验结果 如图2所示。 7 O 6 o s o 重4 o 3 0 2 O 2 O 3 0 4 o 5 O 6 o 7 O 8 O 9 o 提取时间， n l h l 图 2 提取时间对红松仁分离蛋白提取率的影响 F i g 2 Ef lf e c t s 0 f e x t r a c t i o n t i me o n e x t r a c t i o n r a t i o 从图 2可以看 出， 随着加热时间的延长 ， 红松仁 分离蛋 白的提取率逐渐增加 。当浸提时间达到 6 0 m i n时，红松仁分离蛋白的提取率达到最大 ， 为 5 8 8 ，与提取 2 0 m i n时的提取率相 比，增加 了 2 5 2 。 继续延长提取时间， 提取率的变化不大， 说明 在 6 0 m i n 时红松仁分离蛋白的溶出率达到了动态平 衡 。因此 ， 提取时间以 6 0 m i n为宜。 2 1 4 料液比对红松仁分 离蛋 白提取率的影响 按照 1 2 2中( 3 ) 所述 方法进行操作 ， 试验结 果 如图 3所示。 7 O 6 O 堡 5 0 嚣4 o 3 O 2 0 l O O l ：05 1 ： 1 O l ： l 5 1 ： 2 O l ： 2 5 l ： 3 0 1 ： 3 5 料液比， w v 。 图 3 料液比对红松仁分离蛋白提取率的影响 F i g 3 E F e c t s 0 f s o l i d l i q u i d I _a t i o o n e x t I la c t i 0 n I _a t i o 从 图 3可以看 出， 随着料液比的增大 ， 红松仁分 离蛋白提取率也逐渐升高。在料液比为 l ：5时， 由于 溶液的黏度较大， 分子扩散速率较低， 体系分散不均 匀 ， 导致体系 p H不均匀， 影响了浸提液中蛋白质的 溶出， 因而蛋白质的提取率较低。当料液比达到 1 ：2 5 时， 提取率达到最大， 为 6 1 5 。继续增加料液比， 对 提取率没有太大影响。因此， 料液比以 1 ：2 5为宜。 2 1 5 温度对红松仁分离蛋 白提取率的影响 按照 1 2 2中( 4 ) 所述方法进行操作 ， 试验结果 如图 4所示。 7 0 6 O 蔷5 o 鬟4 o 3 O 2 0 2 O 2 5 3 O 3 5 4 O 4 5 5 O 5 5 温度 图 4 温度对红松仁分离蛋 白提取率的影响 F i g _ 4 E f fe c t s o f e x t r a c t i o n t e mp e r a t u r e 0 n e x t r a c t i 0 n r a t i o 从图 4 可以看出，红松仁分离蛋白的提取率随 着温度的升高而增加， 当温度增至 3 5时， 提取率 达到最高为 5 5 7 ， 与 2 5时的提取率相比， 提高了 2 4 8 。 这是由于温度的上升使蛋白质分子的构象发 生改变， 分子的立体结构变得伸展 ， 有利于蛋白质分 子和水分子的相互作用， 使蛋白质的溶解性增大， 提 高了红松仁分离蛋 白的提取率。当温度超过 4 0 时， 由于维持蛋白质空间构象的次级键被破坏， 引起 天然构象解体，促进了蛋白质分子间相互结合而形 成沉淀， 故提取率不再增加。 2 2 正交试验 在单因素实验基础上，对影响红松仁分离蛋白 提取率的温度、 p H、 料液比和提取 时间进行 I J 9 ( 3 ) 正 交试验， 因素水平及编码值见表 l 。试验方案及结果 见表 2 。 表 1 因素水平及编码值 T a b l e 1 F a c t o r l e v e l a n d c o d e s 7 4 黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报 第 2 0卷 从表 2 可知， 通过正交试验分析和极差分析， 对 红松仁分离蛋白提取效果影响顺序为 A c D B ， 即 温度 料液比 时间 p H， 从 K值可知， 最佳工艺组合 为 A ， B 2 C D ： 。由于该条件组合不在正交试验 中， 故需 做验证试验。验证结果为在该组合条件下红松仁分 离蛋 白提取率可达 6 1 0 3 。 因此 ， 红松仁分离蛋白最 佳提取条件为温度 4 0、 料液比 1 ： 2 5 、 时问 6 0 mi n 、 p H9 O。 3结论 采用碱提酸沉法提取红松仁分离蛋白的影响提 取效果顺序为： 温度 料液比 时问 p