聚酰胺分离纯化葡萄籽原花青素及部分产物组分构成的初步研究.pdfVIP

科 学 研 究 食品研究与开发 2 o o 7 V o 2 8 N O 0 2 聚酰胺分离纯化葡萄籽原花青素及 部分产物组分构成的初步研究 7l = - 吴朝霞 ， 孟宪军 。 金嫘 ( 1 沈阳农业大学食品学院， 辽宁 沈阳 1 1 0 1 6 1 ； 2 辽宁省锦州医学院兽医分院， 辽宁 锦州 1 2 1 0 1 3 ) 摘要 ： 以聚酰胺柱层析方法研究了上样流速、 洗脱流速、 丙酮浓度对聚酰胺吸附和洗脱原花青素的影响， 并以 H P L C - MS联检技术初步研究了2 0和 4 0丙酮洗脱片段中的成分构成。结果显示， 上样流速为 0 4 4 ml d m i n ， 在 洗脱流速约为 I m L m i n条件下以 8 0丙酮洗脱时聚酰胺对原花青素的吸附和洗脱效果较好；以 H P L C M s技术 在 2 0丙酮洗脱片段中检出儿茶素、 表儿茶素和两种二聚体， 而在 4 0丙酮洗脱片段中检出四种二聚体。 关键词： 聚酰胺柱层析； 葡萄籽原花青素； 产物成分分析； H P L C MS S TUDY ON S EP ARATI ON AND P URI F I CATI ON OF GRAP E S EED EXT RAC T AND THE COMPOS I T I ON ANALYS I S OF PO nON PRODUCTI ONS I N S EPARATED FRACT I ONS WU Z h a o - x i a ， ME N G X i a n - j u n ， J I N L e i ( 1 F o o d C o H e g e ， S h e n y a n g Ag r i c u l t u r a l Un i v e r s i t y ， S h e n y a n g 1 1 0 1 6 1 ， L i a o n i n g C h i n a ； 2 J i n z h o u Me d i c al U n i v e rs i ty ， J i n z h o u 1 2 1 0 1 3 ， L i a o n i n g ， C h i n a ) Ab s t r a c t ： Th e e ff e c t o f s a mp l e l o a d i n g ， e l u t i n g v e l o c i ty， a s we l l as a c e t o n e c o n c e n a t i o n o f o n a d s o r pt i o n a n d d e s o rpt i o n o f p r o an t h oc y an i di n s i n Po l y am i d e c o l u mn c h r o ma t o g r a p h y we r e s t u d i e d P a r t s o f t h e c o mp o s i t i o n i n s e p a r a t e d f r a c ti o n s we r e d e t e r mi n e d b y HPL C MS Th e s u i t a b l e c o n d i tio n s we I -e l o a d i n g u p wi th 0 4 4 mL mi n c r u d e gra p e s e e de x t r a c t an d e l u t i n gwi th 8 0 a c e t o n e a t the e l u t i ng v e l o c i ty o f 1 mL mi n Ca t e c h i n ， e p i c a t e c h i n an d t o w d i mme rs we r e d e t e r mi n e d i n the fra c ti o n o f 2 0 a c e t o n e b y PR HPL C W h i l e f o u r d i mme rs We r e d e t e rm i n e di nthefra c ti o n o f 4 0 a c e t o n e Ke y wo r d s： P o l y am i d e c o l u mn c h r o ma t o gra p h y ； gra pe s e e d e x tra c t ； c o mp o s i t i o n an aly s i s ； HP LC MS 作者简介 ： 吴朝霞( 1 9 7 1 一 ) ， 女( 汉) ， 副教授 ， 博士 ， 研究方向： 食品营养与卫生、 功能性食品。 _一 _ 日 H I 1 。 ： I 1 I II I _ I I E l I I- I _ I I一 hH ql H I 一 I I 3 1 -3 2 【 6 】 H u t a b a r a t L S e t a1 I sofl a v o n e s a n d e o u me s t r o l i n s o y b e ans and s o y b e a n p r o d u c t s f r o m Au s t r a l i a and I n d o n e s i a啪， J o u r n al o f F o o d C o m- p o s i t i o n and A n a l y s i s ， 2 0 0 1 ( 1 4 ) ： 4 3 - 5 8 【 7 】 B a h r a m H A r j ma n d i ， e t al， S o y b e a n i sofl a v o n es o s t e o p mt ecti v e r o l e i n p o s t me n o p a u s al w o m e n ： me c h ani s m o f a c t i o n J 1 J o u rna l o f N u t r i t i o n al B i o e h e m i s t r y ， 2 0 0 2 ( 1 3 ) ： 1 3 0 1 3 7 【 8 】 T h o m a s B C l a r k son E s t r o g e n i c soy b e a n i s o fl a v o n es and c h r o n i c d i s e a s e ： r i s k s and b e n e fi ts J 1 T E M， 1 9 9 5 ( 6 ) ： 1 1 - 1 7 【 9 1 S u z a n n e He n d r i e h B i eav a i l a b il i t y o f i sofl a v o n e s J 1 J o u r n a l o f C h r o - m a t o g r a p h y B， 2 0 0 2 ( 7 7 7 ) ： 2 0 3 - 2 1 0 【 1 0 】Qi n g - H e Me n g ， e t a1 I n c o r p o r a t i o n o f e s t e r fi e d soy b e a n i sofl a v o n es w i t h anti o x i d a n t acti v i t y i n t o l o w d e n s i ty l i p o p r o t e i n J 1 B i o c h i mi e a e t B i o p h y s i e a A c ts 1 9 9 9 ( 1 4 3 8 ) ： 3 6 9 3 7 6 1 l l 郭京晓 等 大豆异黄酮的研究开发与利用阴大豆通报 ， 2 0 0 3 ( 3 ) ： 2 2 2 3 【 1 2 】S u z a n n e He n d r i e h B i eav all a b il i ty o f i s o t l a v o n es 阴，J o u mal o f C h r o - ma t o g r a p h y B ， 2 0 0 2 ( 7 7 7 ) ： 2 0 3 - 2 1 0 【 1 3 】C HO I Y S ，e t a1 C o n c e n t r a t i o n o f p h y t o e s t r o g e n s i n soy b e a n s and soy bean p r o d u c ts i n K o r e a 们J A g I i c F o o d C h e m ， 2 0 0 0 ( 8 0 ) ： 1 7 0 9 l 7l 2 【 l 4 】 李平华， 王兴文 大孔吸附树脂在中药有效成分分离纯化中的研 究进展阴 云南中医药医院学报， 2 0 0 3 ， 2 6 ( 3 ) ： 4 3 4 5 1 5 1董怀海， 谷文英 三波长比色法测定大豆异黄酮的研究啪 中国油 脂， 2 0 0 2 ， 2 7 ( 4 ) ： 7 5 7 7 收稿 日期 ： 2 0 0 6 - 0 9 - o 1 维普资讯 7 2 2 o o 7 V o L 2 8 N O 0 2 食品研究与羿发 科 学 研 究 葡萄籽原花青素作为一种新型的抗氧化 自然资源 越来越受到人们 的广泛关注，特别是产品中的低聚原 花青素尤其是二聚体尤为重要， 因此 ， 对低聚体尤其是 二聚体的定性和定量分析就显得更加重要 ，这也是研 究中的难点。但 目前国内的研究多集中在对原花青素 的分离提纯技术方 面【 卜 同 ， 对产品的组分构成研究报道 很少。 本文以聚酰胺柱层析技术分离提纯原花青素 ， 并 以 H P L C M S联检技术定性分析了部分纯化产物的组 成成分 ，为该项研究的深入展开和相关产品的研究开 发提供了必要的理论和方法。 1 材料和方法 1 1 材料 脱脂葡萄籽： 由本实验室经超临界萃取制备； 聚酰胺：中国医药集团上海化学试剂公司；儿茶 素 ： S i g m a公司； 色谱纯甲醇 ： 天津康科得科技有 限公 司。 1 2 仪器设备 D B S 一 1 0 0电脑全 自动部分收集器； H L _ 2恒流泵 ； H D 一 3紫外检测仪 ； 7 2 0 0型万分之一天平 ； U V 一 2 6 0紫 外 一可见分光光度计； R E 一 5 2型旋转蒸发仪； 冷冻干燥 设备 ； H P L C： Wa t e r s 2 6 9 5 ； T D A 2 9 9 6 检测器 ； N O V A P a k C 。 柱 ：美 国 Wa t e r s 公司； Z Q 4 O O O质谱检测器 ；美国 Wa t e r s 公司 。 1 3 方法 1 3 1 脱脂葡萄籽中原花青素粗提液的制备 准确称取脱脂的葡萄籽 1 0 0 g ， 以料液比 1 ： 6的比 例加入 8 0 的乙醇溶液 ， 调节 p H值为 5 0 ， 于 6 0的 温度下提取原花青素 ， 浸提时间 9 0 m i n ， 以4 0 0 0 r m i n 的速度离心 1 5 mi n ， 取上清液 ， 再按上述步骤加入乙醇 提取 ， 共提取 3次 ， 合并上清液 ， 于 0 9 0 M P a ， 4 0条 件下真空浓缩至 6 m g m L左右。 1 3 2 上样流速对聚酰胺吸附原花青素的影响 将经过预处理的聚酰胺湿法装柱 ，以蒸馏水冲至 流出液不浑浊为止 。取上述粗提液于 0 3 m L m i n 0 7 m L m i n的不同流速上样 ， 2 8 0 n m检测 ， 每 5 m i n收 集一管 ， 记录吸光值。将洗脱液合并 ， 浓缩 ， 冷冻干燥 ， 计算吸附率。 1 3 3 不同洗脱流速对洗脱效果的影响 用 8 0浓度的丙酮以 0 5 m L m i n 1 2 m L mi n的 不同流速洗脱 ， 将洗脱液合并 ， 浓缩 ， 冷冻干燥 ， 测定产 物的解吸率和纯度。 1 3 4 分级洗脱及各部分洗脱产物的组分构成研究 将吸附至饱和的聚酰胺依次用 2 0、 4 0 、 6 0、 8 0 的丙酮溶液分级洗脱 ， 产物真空浓缩 、 冷冻干燥 ， 测定各段洗脱液的得率； 用少量甲醇溶解各洗脱产物 ， 取 1 0 L注入至液谱 一质谱联检系统中初步定性分 析产物组成 ，其流动相为 A 一2乙酸溶液 ， B 一水： 甲 醇： 乙酸 = 6 8 ： 3 0 ： 2 ， 线性梯度洗脱。质谱分析条件 ： 负离 子扫描( E S I ， m z 2 0 0 l 5 0 0 ) ， 毛细管 电压 4 2 k V， 锥孔 电压 5 0 V， 光电倍增器电压 6 5 0 V， 离子源温度 1 2 0， 脱溶剂气温度 3 0 0。 2 结果与分 析 2 1 上样流速对聚酰胺吸附原花青素的影响 上样流速对聚酰胺吸附原花青素的速度和程度有 较大的影响。聚酰胺吸附原花青素的机理是原花青素 与聚酰胺发生氢键反应 ，即聚酰胺选择性地吸附原花 青素的某些单体成分。上样流速对聚酰胺吸附原花青 素的影响见图 1 ， 表 1 。 0 0 0 0 0 25 50 75 l 00 时 间( mi n ) Ti m e 图 1 上样流速对聚酰胺 吸附原花青素 的影响 Fi g 1 I nflu e n c e o f flo w r a t e o fs a m p l e l o a d i ng o n t h e a d s o r p t i o n o f p r o a n th o c y a n i di n s 表 1 不 同上样流速对聚酰胺 吸附效果 的影响 Ta b l e1 The ad s o rp t i o nrate of d i ffe nt flo wrate of s a mp l el oa d i ng 上样流速 F l o w r a t e o f s a m p l e l o a d i n g ( m L mi n )0 3 0 0 4 4 0 6 8 0 7 1 吸附率 A d s o r p t i o n r a t e ( )4 6 2 4 5 8 3 9 0 3 8 5 由图 1 和表 1 可见， 虽然较低的流速对吸附有利 ， 但 流速过低，操作时间长，而且从吸附率来看， 0 3 m L m i n 上样流速的吸附率与上样流速为 0 4 4 mL m i m的吸附率 相差不大。考虑到实际生产隋况， 选取 0 44 m L m i n的上 样流速比较适合。 2 2 不同洗脱流速对洗脱效果的影p fl( 见图2 、 表 2 ) 0 6 昌 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 5 0 mLrai n 7 7 mLra i n 1 6 mLr a i n 时 间( mi n) Ti me 图 2 洗脱流速对聚酰胺洗脱原花青素 的影响 Fi g 2 I n flue n c eo fe l u t i n gflo w ra te o n a d s o rp t i o n p r o an th o c y a ni d i ns n n n n m m m m L L L L m m m m O 4 8 l 3 4 6 7 O O O O 一 士：I( 维普资讯 科 学 研 究 霰 囊 霸器羧 2 0 0 7 V o L 2 8 N O 0 2 ， = = 烹= = = = 黑 = ， 一 j ! 一 表 2 不同洗脱流速对聚酰胺解 吸效 果的影 响 1 0 0 Ta b l e 2 The d e s o r p t i o n e ffe c t s u n de r d i f f e r e n t e l u t i n g flo w r a t e 洗脱流速 E l u t i n g fl o w r a t e ( m L m i n )0 5 0 0 7 7 1 1 6 解吸率 D e s o r p t i o n r a t e ( ) 纯度 P u r i t y( ) 5 4 3 5 1 1 5 25 8 7 5 8 7 0 8 8 0 图 2表明随洗脱流速的加快 ， 达到洗脱峰值的时 间越短。 对比表 2中的解吸率不难发现 ， 几种洗脱流速 的解吸率没有明显差异 ，可能是各处理的洗脱时间较 长 ， 洗脱进行得比较彻底的缘故。 而几种洗脱产物的纯 度大致相当。这说明可以适当增加洗脱的速率以达到 较高的生产率。另外， 3 种流速洗脱过程的拖尾现象十 分明显，原因是紫外检测系统是在蒸馏水状态下调零 点的， 而丙酮溶液在 2 8 0 a m处有较高的吸收。 2 3 丙酮的分级洗脱研究 将吸附至饱和的聚酰胺依次用不同浓度的丙酮于 1 0 m l J m i n的流速洗脱 ， 结果见表 3 。 表 3 丙酮分级洗脱 效果研 究 Ta bl e 3 Effe c t o f g r a di n g e l u t i o n b y a c e t o n e 堕 望 鲨 壁 ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 兰 ! 洗脱率 E l u t i n g r a t e ( )0 1 5 2 7 6 6 8 2 表 3 结果表明，当洗脱液中丙酮浓度为 2 0时， 洗脱液的极性相对较大 ， 几乎不能洗脱下来原花青素， 产物可能是小分子的酚酸及其它杂质。当丙酮浓度为 4 0时， 洗脱液极性仍然较大， 被洗脱下来的原花青素 增多； 当浓度增加到 6 o时 ， 可洗脱下来的原花青素 最多， 占能被洗脱下来的原花青素总量的 7 6 6。 利用 不同浓度的丙酮溶液创造 了不同的极性环境 ，从而有 助于将不同聚合度的原花青素，特别是把寡聚体片段 分开来， 以获得所需的目的片段。 2 4 2 0和 4 0丙酮洗脱片段的组成成分初步分析 观察色谱图( 图 3 图 6 ) 分析 ， 2 0片段中保 留 时间为 2 O 1 6 m i n和 3 6 3 9 m i n的物质分别为儿茶素 和表儿茶素。另外 ， 检出了两种二聚体 ， 保留时间分 别为 2 6 0 7 ra i n ， 2 8 0 7 ra i n 。 在 4 0的丙酮洗脱液中， 图 3 2 0洗脱 片段的 R P HP L C分析 Fi g 3 RP-HPLC a na l y s i s o f f r a c t i o n 2 0 f r o m g r a ding e l u t i o n 一 36 65 1 0 0 0 20 00 3 0 0 0 40 00 50 00 6 0 0 0 图 4 2 0丙酮分级洗脱片段的选择离子流图 Fi g 4 M S c h r o ma t o g r a ph e r a n a l y s i s o f f r a c t i o n o f2 0 a c e t o ne 4 8 5 5 0 0 l 0 0 0 l 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 3 0 0 0 3 5 0 0 4 0 0 0 4 5 0 0 5 0 0 0 5 5 0 0 6 0 0 0 图 5 4 0丙酮分级洗脱片段的 RP H P L C分析 F i g 5 RP- HPLC an a l y s i s o f f r a c t i o n o f4 0 a c e t o ne 1 00 0 1 0 00 20 00 30 00 40 00 5 0 00 60 00 图 6 4 0丙酮 分级洗脱片段 的选择离子流 图 Fi g 6 M S c h r o m a t o g r a p h e r a n a l y s i s o f f r a c tio n 0 f4 0 a c e t o n e 维普资讯 7 4 黛晶誊 i f 究与并发 科 学 研 究 荔枝核褐色素的精制研究 黄雪松 。 陈杰 ( 暨南大学理工学院食品科学与工程系， 广东 广州 5 1 0 6 3 2 ) 摘要 ： 利用荔枝核资源生产褐 色食用色素， 采用 A B 一 8、 N K A I I、 N K A 一 9 、 DI O 1 - C 、 D 2 0 1 - C等树脂， 研究了其吸 附、 洗脱等工艺参数对所产荔枝核褐色素的影响。结果表明： A B 一 8树脂较适宜荔枝核褐色素的精制 ； 在所选用色 谱柱条件f 内径 0 9 5 c m， 长 4 5 c m ) T， 吸附及洗脱温度均为常温， 上样色素溶液的吸光度为0 4 6 8 ( 稀释 1 0 0倍) ， 以 1 0 mld mi n的 8 0乙醇洗脱， 可使荔枝核褐 色素的色价提高到 l 1 6 4 8 。这些结果表明： 利用废弃的荔枝核生产荔 枝核 褐 色素是 可行 的。 关键词 ： 荔枝 ( L i t c h i C h i n e n s i s S o o n ) ； 荔枝核 ；色素 作者简介： 黄雪松( 1 9 5 7 一 ) ， 男( 汉 ) ， 教授， 博士， 主要从事食品化学与食品加工工艺方面的研究。 I_ II l 1 Il I _ Il - -I_一 I - 1lI _ l- I l “ 1 I l- 1 f I _ l 。 l I l I _I _ I l l l 检出了至少 四种二聚体( 保留时间分别为 1 0 5 2 mi n ， 1 7 2 7 mi n。 1 9 1 6 mi n。 2 8 2 6 mi n) 。 3讨论 根据报道， 二、 三聚体原花青素的碎片断裂方式主 要包括 R D A反应( r e t r o D i e l s A l d e r 反应 ) 及黄酮问连 接键的断裂17 - o l ， 在黄酮骨架结构的 c 一环上发生 R D A 反应后可能失去一个中性的 c B H O ， 结构( 相对分子质 量 1 5 2 ) ， 形成的离子片段还可以进一步失去一分子水。 在本试验条件下， 验证了该种断裂方式。 通过图谱分析 还可以看出在该质谱检验条件下 ，原花青素二聚体的 断裂方式各不相同，可能与二聚体各键的连接方式有 很大的关系， 目前国内外尚未见有关的报道， 还有待在 试验操作条件和理论方面做进一步的研究。 此外 ， 在该 色谱条件下， 6 0和 8 0 的洗脱片段未能出峰，说明 这两个片段中没有单体 、 二聚体的存在， 对这两个洗脱 片段的 H P L C M S 检测条件还有待进一步研究。 4结论 4 1 上样流速可影响聚酰胺对原花青素的吸附， 确定 上 样流速为 0 4 4 m L m i n 时较为适宜 。 4 2 以 8 0 的丙酮溶液洗脱时， 洗脱流速对解吸率影 响不大， 洗脱产物的纯度也相差不大， 因此， 可以适当增 加洗脱的速率( 约为 1 mL m i n ) 以达到较高的生产率。 4 3 以丙酮分级洗脱时， 绝大部分的原花青素被 6 0 的丙酮溶液解吸， 解吸率为 7 6 6 ； 其次是 4 0丙酮 溶液， 解吸率为 1 5 2 。 4 4 以 H P L C M S联检技术定性分析了 2 0和 4 0 洗脱片段中的原花青素构成。 在 2 0丙酮洗脱片段中 检出儿茶素、 表儿茶素和两种二聚体 ； 而在 4 0丙酮 洗脱片段中检出四种二聚体 ，还有一些物质尚有待进 一 步研究确定。 参考文献： 【 1 】 李凤英， 李春华 葡萄籽中原花青素提取工艺研究 J J 中国食品学 报，2 0 0 3 ( 1 2 ) ： 6 7 7 0 2 1 吕丽爽， 曹栋、 薄层色谱法分离葡萄籽中的低聚原花青素 J 】 无锡 轻工 大学学 报，2 0 0 1 ，2 0 ( 1 ) ：6 5 6 7 、 【 3 】 孙芸， 谷文英大孔吸附树脂对葡萄籽原花青素的吸附研究 J J 璃 子交换与吸附，2 0 0 3 ， 1 9 ( 6 ) ：5 6 1 5 6 6 4 1 赵文军， 吴雪萍， 王旭 葡萄籽中低聚原花青素提取条件的研究们 食品科学。 2 0 0 4 ， 2 5 ( 2 ) ： 1 1 7 1 2 0 5 15 刘睿， 谢笔钧， 潘思铁， 等 高粱种子外种皮中原花青素提取、 纯化 及其抗氧化活性的研究 J J 中国粮油学报， 2 0 0 3 ， 8 ：4 3 - 4 7 6 16 傅武胜， 赵道辉， 黄剑锋 紫外分光光度法测定葡萄籽提取物中的 原花青素含量 食品研究与开发2 0 0 2 ， 2 3 ( 6 ) ： 9 0 9 2 7 1 B a o s h a n S u n ， G P e d r o B e l e h i o r ， J M Ri c a r d o - d a - S il v a , e