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2009年11月 第24卷第11期 中国粮油学报 Journal of the Chinese Cereals and OilsAssociation Vol . 24,No. 11 Nov . 2009 黑豆蛋白质酶水解物体外抗氧化活性的研究 刘恩岐 1 贺菊萍 1 陈振家 2 刘虎平 2 李玉娥 2 (徐州工程学院食品工程学院食品资源开发与利用重点建设实验室 1 ,徐州 221008) (山西农业大学食品科学与工程学院 2 ,太谷 030801) 摘 要 采用Alcalase、Neutrase和Flavourzyme蛋白酶水解2种不同类型的黑豆蛋白,在其最适水解条件 下,通过单酶水解和分阶段多酶复合水解方式制备黑豆蛋白水解物,利用邻苯三酚自氧化法测定比较其体外 抗氧化活性。结果表明:在水解度相近的情况下,早熟大粒黑豆蛋白的Alcalase单酶水解物的抗氧化活性高于 晚熟小粒黑豆蛋白;在水解时间相同的情况下,黑豆蛋白的Alcalase单酶水解物的抗氧化活性高于Neutrase和 Flavourzyme蛋白酶;Alcalase和Neutrase分阶段水解90 min高于Alcalase单酶水解4 h的黑豆蛋白水解物的 抗氧化活性;试验获得的具有较高抗氧化性的质量分数为2%的黑豆蛋白酶水解物,对邻苯三酚自氧化的抑制 率与0. 01%的维生素C水溶液相近。 关键词 黑豆蛋白 酶水解 抗氧化活性 中图分类号: TS201. 2 文献标识码:A 文章编号: 1003 - 0174 (2009) 11 - 0038 - 04 基金项目:山西省留学归国人员科研资助计划项目(2007059) 收稿日期: 2008 - 11 - 20 作者简介:刘恩岐,男, 1964年出生,教授,食品科学与工程 种皮为黑色的大豆称为黑豆,其蛋白质及赖氨 酸、 苏氨酸、 蛋氨酸等氨基酸含量高于黄豆及其他颜 色的大豆 1 ,属高蛋白低脂肪类型大豆。黑大豆抗 旱耐瘠、 适应性广,在全国各地都有栽培,尤以山西、 陕西等地种植较为普遍 2 ,是我国广为种植而又区 域性分布相对集中的优质植物蛋白资源。但黑豆质 硬不易消化,且苦涩味较重、 适口性不佳,除少量药 用或加工成豆豉等食品外,一直没有得到大量开发 利用 3 ;特别是有关黑豆蛋白的改性技术研究相对 滞后,使其深加工利用受到了限制。 国内外研究发现,通过对蛋白质适当酶解可得 到大量具有各种生物功能的活性肽,其中研究报道 最多的是大豆蛋白肽,大豆肽在原大豆蛋白序列中 并无活性,一般通过胃肠道消化时释放出来的很少, 但通过体外定向酶解可将这些活性肽释放出来并加 以浓缩,酶水解得到的大豆肽具有与天然活性肽类 似或相同的功能 4 ,具有抗氧化和增强体能等多种 生理功能,尽管活性稍低,但价廉易得,易于吸收,安 全性极高,已成为功能性食品基料及肽类药物开发 研究中的新热点 5 - 6 。本研究以化学成分和遗传性 质稳定的山西黑豆为试验材料,采用碱提酸沉法提 取黑豆分离蛋白,利用Alcalase碱性蛋白酶、Neutrase 中性蛋白酶和Flavourzyme风味蛋白酶对黑豆分离蛋 白进行单酶和多酶分步复合水解,获得黑豆蛋白质 酶水解物,通过邻苯三酚自氧化法测定黑豆蛋白水 解物对超氧阴离子自由基的清除能力,研究黑豆蛋 白水解物的体外抗氧化活性,为高活性抗氧化黑豆 蛋白肽的进一步开发研究提供理论依据。 1 材料与方法 1. 1 材料与仪器 早熟大粒黑豆“ 黑宝石 ” 、 晚熟小粒黑豆“ 黑珍 珠 ”:山西农业大学大豆育种研究室提供;大豆分离 蛋白:湖北鑫华食品有限公司; Alcalase碱性蛋白酶 (2. 4 AU /g)、Neutrase中性蛋白酶(0. 8 AU /g)、Fla2 vourzyme风味蛋白酶(500 LAPU /g) :丹麦诺维信(中 国)生物技术有限公司;邻苯三酚、 甲醛、 三羟甲基氨 基甲烷等:均为分析纯,上海国药集团。 DL - 5型低速大容量离心机:上海安亭科学仪 器厂;低速小容量离心机:常州国华电器有限公司; 723C型可见分光光度计:上海欣茂仪器设备有限公 司。 1. 2 试验方法 1. 2. 1 黑豆蛋白的提取 将黑豆去皮粉碎,经石油醚脱脂后风干得到脱脂 黑豆粉。将脱脂黑豆粉加10倍蒸馏水搅拌15 min, 用1 mol/L氢氧化钠调pH为8. 0, 4 000 r/min离 第24卷第11期刘恩岐等 黑豆蛋白质酶水解物体外抗氧化活性的研究 心15 min,取上清液用1 mol/L盐酸调pH为4. 5, 4 000 r/min离心15 min,取沉淀物加2倍蒸馏水,水 洗离心两次,将沉淀物真空干燥后得到黑豆分离蛋 白。 1. 3. 2 酶水解物的制备 在Alcalase碱性蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶和 Flavourzyme风味蛋白酶最适水解温度和pH条件下, 对早熟黑豆蛋白、 晚熟黑豆蛋白和市售大豆分离蛋 白分别进行单酶水解和多酶分步复合水解。具体方 法如下:称取10 g黑豆蛋白或市售大豆分离蛋白,分 散于100 mL蒸馏水中,置于95 水浴锅中加热10 min,使蛋白质变性,分子结构变得松散致使酶水解 的作用点增加,以利于酶解反应的进行 7 ,将预处理 好的蛋白液调节到适当的温度和pH条件下,加入一 定量的单酶或分步加入23种不同组合的蛋白酶, 水解一定时间后,在90 水浴锅中加热5 min灭酶, 离心分离(4 000 r/min, 10 min)后取上清液测定水解 度和抗氧化活性。 1. 3. 3 水解度的测定 采用甲醛滴定法 8测定蛋白质酶水解液的水解 度,取5 mL酶解液,加入60 mL去离子水,用0. 1 mol/L的NaOH滴定至pH为8. 2,加入中性甲醛20 mL,继续滴定至pH为9. 2,记录pH 8. 2到pH 9. 2 消耗NaOH的体积。水解度的计算见公式(1)。 DH = (V - V0)C/ (7. 8M W) (1) 式中:V为滴定至9. 2消耗NaOH的体积/mL; V0为滴定至8. 2消耗NaOH的体积/mL; C为氢氧化 钠浓度, 0. 1 mol/L;M为5 mL酶解液中底物的质量/ g;W为底物中蛋白质的质量分数/%; 7. 8为每克蛋 白质中肽键的物质的量/mmol/g。 1. 3. 4 酶水解液抗氧化活性的测定 采用邻苯三酚自氧化法测定蛋白酶水解液的体 外抗氧化活性,邻苯三酚在碱性Tris - HCl缓冲液( pH 8. 2 )条件下能迅速自氧化,释放出超氧阴离子 O 2并生成黄棕色的中间产物,中间产物在325 nm 处有强烈的光吸收,吸光度与邻苯三酚自氧化程度 呈线形关系。当有抗氧化剂存在时,可清除O 2,从 而阻止中间产物的积累,导致产物颜色较浅,采用分 光光度计对产物进行比色分析,可以检测该抗氧化 剂清除O 2自由基的能力 9 - 10 。 在比色杯中依次加入3 mL0. 05 mol/L的Tris - HCl缓冲液(pH 8. 2) , 0. 1 mL质量分数为2%的蛋 白酶解液(空白组加入同体积的蒸馏水) , 0. 1 mL 0. 45 mol/L邻苯三酚溶液,振荡并计时,待计时至 3 min时立即加入0. 1 mL3%的维生素C溶液,振荡 终止反应,在325 nm处测吸光度A。维生素C是一 种高效的抗氧化剂,为准确测定吸光度,在本试验中 维生素C作为邻苯三酚自氧化反应的促停剂来使 用。 以空白的吸光度为A0,加蛋白酶解液抗氧化剂 时吸光度为AS,清除自由基活力SA用蛋白酶解液对 邻苯三酚自氧化的抑制率来表示。并以质量分数为 0. 01%维生素C和2%的谷胱甘肽作为阳性对照,分 析比较其体外抗氧化活性。计算方法见公式(2)。 SA=A 0- As A0 100%(2) 2 结果与分析 2. 1 黑豆蛋白单酶水解产物的抗氧化结果分析 2. 2. 1 Alcalase蛋白酶对黑豆蛋白的水解曲线和抗 氧化曲线 11 料水比为110,加酶量为蛋白质底物质量的 2% ,在pH值8. 0、 温度60 的Alcalase碱性蛋白酶 最适水解条件下,早熟大粒黑豆蛋白酶水解物的水 解度DH和抗氧化活性SA与水解时间的关系见图 1。酶水解物的水解度随水解时间的增加而增大,抗 氧化活性随水解度的增加而增大,当水解时间达4 h 以上时,水解度接近15% ,对邻苯三酚自氧化的抑制 率接近12%时,继续延长水解时间,水解度和抗氧化 活性都基本不再增加。 图1 黑豆蛋白质酶水解曲线和抗氧化曲线 2. 1. 2 三种大豆蛋白的Alcalase蛋白酶水解物的抗 氧化性比较 在Alcalase碱性蛋白酶最适水解条件下,对早熟 黑豆蛋白、 晚熟黑豆蛋白和市售普通大豆分离蛋白 水解45 h,至水解度接近15% ,三种大豆蛋白酶水 解物的水解度均基本不再增加,其抗氧化活性测定 93 中国粮油学报2009年第11期 结果见表1。在水解度基本接近的条件下,早熟黑豆 分离蛋白酶水解物的的抗氧化活性最高,可能与三 种大豆蛋白的氨基酸组成一级结构不同致使水解物 中存在的肽的种类不同有关。 表1 三种大豆蛋白的Alcalase蛋白酶水解物的抗氧化性比较 大豆蛋白种类水解度/%抗氧化活性/% 早熟黑豆分离蛋白14. 811. 7 晚熟黑豆分离蛋白14. 69. 5 市售大豆分离蛋白14. 57. 3 2. 1. 3 三种蛋白酶对黑豆蛋白的酶水解产物的抗 氧化性比较 在Alcalase碱性蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶和 Flavourzyme风味蛋白酶各自的最适水解条件下,对 早熟黑豆分离蛋白水解4 h,三种蛋白酶对黑豆蛋白 的酶水解产物的水解度和抗氧化活性比较见表2。 Alcalase碱性蛋白酶的水解液的抗氧化活性最高, Neutrase中性蛋白酶次之, Flavourzyme风味蛋白酶所 获得的水解液水解度最高而抗氧化活性却最差。从 酶水解过程的机制考虑,起码有两个方面的因素影 响水解产物的组成。不同酶类具有不同的水解专一 性,Alcalase和Neutrase属于内切酶, Flavourzyme含 有内切蛋白酶和外切肽酶两种活性,这是造成水解 物组成差异的最主要因素;另一方面,在不同的pH 环境中底物大分子的结构(尤其是构象)将呈不同的 状态,因而也造成水解产物组成的差异 12 。 表2 三种蛋白酶对黑豆蛋白的酶水解产物的抗氧化性比较 蛋白酶种类pH温度 加酶量/%水解度/%抗氧化活性/% Alcalase8. 0602. 014. 511. 7 Neutrase7. 0502. 010. 98. 4 Flavourzyme7. 0503. 016. 25. 6 2. 2 黑豆蛋白多酶分步水解产物的抗氧化结果分析 蛋白质水解过程中伴随着质子的释放,水解液 的pH会不断下降,采用Alcalase酶水解30 min,水解 液的pH值由8. 0降至Neutrase酶和Flavourzyme酶 的最适pH值7. 0时,加热钝化Alcalase酶,加入 Neutrase酶和Flavourzyme酶继续水解60 min,在pH 渐变并满足不同酶最适水解条件下,不同多酶组合 分步水解早熟黑豆蛋白的水解度和抗氧化活性测定 结果见表3。 Alcalase酶水解30 min后Neutrase酶水解60 min,与Alcalase单酶水解4 h水解液的水解度相接 近,且抗氧化活性有所提高。Alcalase酶和Neutrase 酶水解后,再经Flavourzyme酶水解的水解液的水解 度有较大提高,但抗氧化活性却比Alcalase酶和 Neutrase酶双酶水解物有较大幅度降低; Alcalase酶 或Neutrase酶水解后,经Flavourzyme酶继续水解的 水解液的水解度有较大提高,抗氧化活性却比Alca2 lase酶或Neutrase酶单酶水解物有较大幅度降低,从 理论上推断可能与Flavourzyme酶含有外切肽酶有 关,即酶水解物中抗氧化性较弱的游离氨基酸比例 增加,因而降低了其抗氧化活性。 表3 黑豆蛋白多酶分步水解产物的抗氧化活性比较 加酶次序与水解时间 Alcalase酶Neutrase酶Flavourzyme酶 水解度 /% 抗氧化活性 /% 30 min30 min30 min17. 86. 5 30 min60 min13. 812. 9 30 min60 min18. 14. 5 60 min30 min16. 15. 2 2. 3 黑豆蛋白酶水解物与水溶性抗氧化剂对邻苯 三酚自氧化抑制率的比较 质量分数为2%的早熟黑豆蛋白酶水解物与 0. 01%的维生素C及2%的还原型谷胱甘肽水溶液 的抗氧化性的比较见图2。Alcalase单酶水解4 h的 水解物对邻苯三酚自氧化的抑制率与0. 01%的维生 素C相近, Alcalase酶与Neutrase酶分阶段水解90 min的水解物的抗氧化性略高于0. 01%的维生素C, 但二者的抗氧化活性均只有2%的还原型谷胱甘肽 水溶液的1 /7左右,说明黑豆蛋白酶水解物的体外 抗氧化活性与高活性高纯度抗氧化肽相比还具有很 大差距。 图2 黑豆蛋白水解物与维生素C及谷胱 甘肽水溶液的抗氧化性比较 3 结论与讨论 3. 1 在Alcalase碱性蛋白酶最适水解条件下,黑豆 蛋白酶水解物的抗氧化活性高于市售普通大豆分离 蛋白,早熟大粒黑豆蛋白的抗氧化活性高于晚熟小 04 第24卷第11期刘恩岐等 黑豆蛋白质酶水解物体外抗氧化活性的研究 粒黑豆蛋白,可能与不同类型大豆蛋白的氨基酸组 成与亚基结构有关。 3. 2 在3种不同蛋白酶各自的最适水解条件下水 解黑豆蛋白4 h,Alcalase蛋白酶的水解液的抗氧化 活性最高,Neutrase蛋白酶次之, Flavourzyme风味蛋 白酶所获得的水解液水解度最高而抗氧化活性却最 差。可能与不同酶的水解专一性不同造成水解产物 组成的差异有关。 3. 3 Alcalase酶与Neutrase酶分阶段水解90 min的 黑豆蛋白水解物,其抗氧化性高于Alcalase酶及Neu2 trase酶单酶水解4 h的水解物;但Alcalase酶、Neu2 trase酶与Flavourzyme风味蛋白酶组合,分阶段水解后 却降低了的水解液的抗氧化性,说明通过简单的多种 酶组合水解方式并不能改善水解液的抗氧化活性。 3. 4 试验获得的具有较高抗氧化性的黑豆蛋白酶 水解物,对邻苯三酚自氧化的抑制率与0. 01%的维 生素C水溶液相近,但与2%的还原型谷胱甘肽水溶 液相比还存在很大差距,拟对酶水解物进一步分离 纯化,以期制备高纯度高活性的抗氧化黑豆蛋白肽。 参考文献 1陆恒.黑豆蛋白质的营养价值优势及利用对策J .中国 商办工业, 2003 (2) : 40 - 42 2常汝镇.中国黑豆资源及其营养和药用价值J .中国食 物与营养, 1998 (5) : 38 - 39 3张瑞芬,池建伟,丘银清,等.黑大豆的营养及保健功能研 究进展J .广东农业科学, 2006(11) : 13 - 16 4Gill,Lopez Fandino R, Jorba X, et al . 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Antioxidation Activity i n vitro of Enzym ic Hydrolysates from Black Soybean Liu Enqi 1 He Juping 1 Chen Zhenjia 2 Liu Huping 2 Li Yu e 2 (School of food technology, Xuzhou Institute of technology 1 , Xuzhou 221008) (College of Food Science and Engineering, ShanxiAgriculturalUniversity 2 , Taigu 030801) Abstract The proteins of two types of black soybean were hydrolyzed by alcalase, neutrase and flavourzyme, and with single enzyme type ormulti - enzyme type by stages . The antioxidation activities of the enzymic hydrolysates were compared by the pyrogallol autoxidation method. Results: The antioxidation