基于纯水提取的烟熏鲣鱼中肌苷酸的提取方法.pdf

2 1 6 色 谱 第 3 0卷 故也 称 为 “ 木 鱼 ” ， 用 这种 烟 熏 鲣 鱼 为 主要 成 分 并 配 合各种氨基酸和核酸原料制成的颗粒状调味品又被 称 为“ 木 鱼精 ” ， 它是 日本 家 庭 和 日本料 理 餐 馆 最 常 用 的调 味 品之 一 ， 具 有 独 特 的 鱼 鲜 味 和香 味 。烟 熏 鲣 鱼 中 主 要 的 鲜 味 成 分 是 肌 苷 酸 (i n o s i n i c a c i d) E S , 4 。 肌 苷 酸 又称 为次黄 嘌 呤核 苷酸 ， 最早 于 1 8 4 7年 由德 国 的化学 家 L i e b i g在 牛 肉组织 中发 现 ， 1 9 1 3年 K o d a ma和 K u n i n u k a发 现肌苷 酸 的鲜 味特 征 ， 其 增 加鲜 味 的能 力 比谷 氨酸 钠 强 几 十 倍 ， 其 含 量 是 衡 量 肉质鲜 味的一项重要 指标 。肌苷酸 是一种芳 香 族 化合 物 ， 易溶 于 水 ， 在 中性 和碱 性 溶 液 中稳 定 ， 在 p H 4的条 件下 稳 定性 较 差 ， 容 易降 解 为 次 黄 嘌 呤和 D一 核糖 。但 是 ， 目前 动 物 及 其 他 产 品 中 的 肌苷 酸含 量研 究 普遍 采 用 高 氯 酸 作 为提 取 液 ， 例如 ， Z h a n g等 采用 5 高氯酸提取 畜禽肌 肉中 的肌苷酸； 吴莹莹等 采用 6 高氯酸提取新鲜 肉 鸡胸肌中的肌苷酸 ； 温泉等 采用 5 高氯酸提取 猪 肉 中 的 呈 味 核 苷 酸 肌 苷 酸 ； 吴 波 等 采 用 5 的高氯酸提取酱油 中的肌苷酸等。高氯酸作为 提取液的 p H值远小 于 1 ， 易造成肌苷酸的降解 ， 导 致测定结果 的误差 。此外 ， 由于高氯酸具有强腐蚀 性 和强 刺激 性 ， 极 易在样 品预处 理 时引 发安 全事 故 ， 造 成环 境 的污 染 。 因此 ， 本 文建 立 了 以 9 5 的纯水 作 为提 取 液 ， 提 取 5 mi n的肌苷 酸预 处 理方法 ， 并采 用高效液相色谱法 ( H P L C) 对烟熏鲣鱼 中的肌苷酸 进行了定性和定量分析。与传统的高氯酸提取方法 相 比， 该方法操作安全 、 与环境友好 ， 且提取效率高 ， 是一 个具 有较 强 实 用 性 的 检 测方 法 ， 具 有 一定 的 推 广价 值 l 实验部分 1 1仪 器 与试 剂 A g i l e n t 高 效 液 相 色谱 仪 L C 1 1 0 0 ( 美 国 A g i l e n t 公 司 ， 配 紫 外 检 测器 ) ； 均 质 器 ( 瑞 士 K i n e ma t i c a公 司 ， P T 2 1 0 0型 ) ； 高 速 离 心 机 ( 德 国 S i g ma公 司 ， 3 K1 5 ) ； 数 显 恒 温 水 浴 锅 ( HH一 1 6 ， 国 华 电器 有 限 公 司 ) ； 滤 膜 ( 美 国 Ag i l e n t 公 司 ， 1 3 mm 0 4 5 m) 。 肌 苷 酸 标 准 品 ( 纯 度 为 9 9 ， 德 国 S i g ma公 司) ； 烟熏鲣 鱼( 象 山三英水产有限公 司) ； 甲醇 ( 色 谱 纯 ， 美 国 T E DI A 公 司 ) ； 乙 酸 铵 ( 分 析 纯 ， 国 药 集 团) ； 高氯酸( 优级纯 ， 含量 7 0 7 2 ， 天津光复精 细 化工 研 究所 ) ； 其 他 试剂 均为 国产 分析 纯 。 1 2标 准溶 液的 配 制 准确 称取 l 0 0 mg肌苷 酸 标准 品 ， 用 5 ( v v ) 的 甲醇 水 溶 液 定 容 到 l 0 mL ， 溶 液 质 量 浓 度 为 I 0 g L， 作 为标 准储备液放入 4 冰箱备用。临用前 用 5 的 甲 醇 水 溶 液 逐 级 稀 释 ， 得 到 1 0 、 l 0 0 、 2 0 0、 4 0 0、 8 0 0 、 1 0 0 0和 1 2 0 0 mg L的系 列 标 准 工作 液 。 1 3样 品处 理 取一 定量 的烟 熏 鲣 鱼样 品 ， 先 用 刨 床 刨 成 薄 片 状 ， 再 用 均 质 器充 分 均 质 ， 然 后 放 人 4 冰 箱 中 保 存。在使用时样品用 四分法取样。 纯水 提 取 ： 称 取 烟熏 鲣 鱼样 品 2 5 0 g ， 放 人 2 0 0 mL烧 杯 中 ， 加 入 9 0 mL 9 5 的水 ， 随后 ， 将 烧 杯 放 入恒 温 水浴 中 ， 保 持 水温 在 9 5 ， 蒸煮 5 mi n后 ， 用 滤 纸过 滤 ， 冷却 到室 温后 定 容到 1 0 0 mL 。溶液 采 用 0 4 5 ix m 滤 膜过 滤后 进样 分析 ， 外 标 法定 量 。 高 氯 酸 提 取 ： 称 取 烟 熏 鲣 鱼 样 品 2 5 0 g于 5 0 mL塑料 离心 管 中 ， 加 入 6 ( v v ) 的 高氯 酸溶 液 2 0 mL ， 在漩涡振荡仪上振荡提取 5 mi n ，8 0 0 0 r mi n 离 心 5 rai n ， 倒 入 1 0 0 mL容量 瓶 中 。再用 2 0 mL高 氯酸溶液重复上述步骤。用 4 g L的 N a OH中和高 氯酸 ， 并将 p H调 至 6 5左右 ， 定 容 到 1 0 0 mL 。溶 液 采用 0 4 5 m 滤 膜过 滤后 进样 分 析 ， 外标 法定 量 。 1 4色谱 条 件 色 谱 柱 为 A g i l e n t Z o r b a x S B Cl 8柱 ( 1 5 0 n l m x 4 5 mm， 5 ix m) ； 流 动相 为 甲醇一 5 0 mmo l L乙酸 铵 水溶 液 ( 5 ： 9 5 ， v v ) ； 柱 温 为 3 0 ； 流 速 为 1 0 mL mi n； 如未 做特 殊说 明 ， 进样 量 均 为 l 0 L； 检 测 波 长为 2 5 4 n m。 2结 果 与 讨 论 2 1色谱 条件 的选 择 采用 文献 1 1 报 道 的 甲醇 一 5 0 mmo l L乙酸 铵 作 为流动 相 ， 在依 利 特 H y p e r s i l N H：上分 离 肌苷 酸 ， 峰形 不好 ， 有拖 尾 现象 ， 且 峰形 较 宽 ( 图 1 a ) 。因 此 ， 本 研 究 更 换 色 谱 柱 为 Ag i l e n t Z o r b a x S B C 1 8 柱 ， 保 持 流 动相 甲 醇一 5 0 mmo l L乙 酸铵 不 变 ， 分 离 肌 苷酸 。如 图 1 b所 示 ， 肌 苷 酸 标 准 品 出峰 时 问 为 3 0 2 8 mi n ( 峰 1 ) ， 峰形 较 尖锐 ， 未 拖 尾 。 图 1 c为烟 熏 鲣鱼 的纯 水提 取物 ， 可看 出肌 苷酸 峰形 较 好 ， 未 出 现杂质峰， 满足定量分析的需要。 2 2提 取条 件 的优化 采用纯水作为提取剂 ， 影 响其提取效率 的因素 包 括提 取时 间 和提 取 温 度 。因 此 ， 本 研 究 中考 察 了 提取时间和提取温度对烟熏鲣鱼 中肌苷酸提取效率 的影响。提取参数的考察均 以 H P L C测定烟熏鲣鱼 中肌苷酸的提取浓度为评价指标 ， 每个参数平行测 第 2期 王婷婷 ， 等 ： 基于纯水提取的烟熏鲣鱼中肌苷酸的提取方法 2 l 7 3 。 2 0 毛 。 0 3 b 一 - _ 一 _ _ ， 1 图 1 肌苷酸标准溶液和烟熏鲣鱼提取物的色谱图 Fi g1 HPLC c h r o m a t o g r a m s o f i nos i ni c a c i d s t a nda r d s ol ut i o n a nd t h e e xt r a c t f r om Sm o ked Kat sM wonu s pe l am i s s a m pl e a s t a n d a r d s o l u t i o n o n t h e Hy pe r s i l NH，c o l u m n；b s t a n d a r d s o l u t i O n on t h e Zo r b a x S B C1 8 c ol u mn：Ct he e x t r a c t on t he Zo r b a x S B C】 8 c o l u mn Pe a k i d e n t i fic a t i o n 1 1 i no s i ni c a c i d 定 2次 。 2 2 1 提取 时 间的优 化 样 品 中的待提 取成 分 向溶 剂 中扩散 的程 度 与提 取 时间有 关 ， 提取 时 间越长 ， 越 有利 于待 提取 成 分从 样 品扩散 到 提 取 溶 剂 中 。本 研 究 以 纯 水 为 提 取 溶 液 ， 保持一定的温度 ， 分别对 2 、 5 、 1 0 、 2 0 、 3 0 mi n等 不 同提取时间进： ， 亍了考察 ， 平行测定两次， 测得肌苷 酸 的平 均 含 量 分 别 为 7 2 0 4、 7 6 8 2 、 6 6 5 8 、 5 8 1 5 、 5 6 2 2 g k g 。表明当提取时间为 5 mi n时 ， 提取效 率 最 高 ； 而当提 取 时间 大于 5 mi n时 ， 提取 效率 反 而 下降 ， 这是 因为提取时间越长 ， 肌苷酸发生热降解的 几 率越 大 。因此 ， 本实 验选 择提 取 时问 为 5 mi n 。 2 2 2提 取 温度 的优化 随着 温度 升高 ， 溶 剂 对 提 取 物 质 的溶 解 度 也 在 定范围内增大 ， 同时溶剂分子的运动速度也加快 ， 溶 剂对 样 品 的浸 润 穿透 也 随 之加 快 。本 研 究 对 3 5 、 4 5 、 5 5、 6 5 、 7 5、 8 5 、 9 5 等不 同提取 温度进 行 了考 察 ， 平 行测 定 两 次 ， 测 得 肌 苷 酸 的平 均 含 量 分 别 为 5 4 3 0、 5 9 01、6 3 2 7、6 9 5 4、7 0 4 4、7 3 2 0、7 6 5 6 g k g 。表明温度对提取效率 的影响较大 ， 在 3 5 时 ， 提取 的 肌苷酸 含量 较低 。随着温 度 的增加 ， 提 取 效率逐渐增加。在 9 5 的条件下， 提取效率最高 。 因此 ， 实 验采 取 9 5作 为提 取 的最佳 温度 条件 。 2 3方 法 的性 能指标 2 3 1 线 性关 系 分别 测 定肌 苷 酸 系列 标 准 工 作 溶 液 ， 以 相 应 的 色谱峰面积( Y ) 对其质量浓度 ( X， mg L ) 进行线性 回归 。肌 苷 酸 在 质 量 浓 度 1 01 2 0 0 mg L范 围 内线 性 关 系 良好 ， 其 线 性 方 程 为 Y=l 0 0 0 5 7 X一 7 3 3 4 6， =0 99 9 8。 2 3 2检 出 限与定 量 限 将肌苷酸配制成相应浓度 ， 进样 5 L 。当信噪 比( S N)：3时 ， 方 法 检 出 限为 0 1 mg L ； 当 S N = l 0时 ， 方 法 的定 量 限 为 0 3 mg L 。此 时 定 容 体 积 为 1 0 0 mL， 固体试 样称 样 量 为 2 5 0 g ， 则该 方法 的检 出限为 4 mg k g ， 定 量 限为 1 2 mg k g 。 2 3 3 精 密度和 回收率 按照 上述 纯水 提 取 的最 优 前处理 条件 和色 谱条 件 ， 分别 添加 肌苷 酸标 准 品为 0 4 0 、 2 0 0 、 4 0 0 g k g 的低 、 中 、 高 3个 水 平 ， 平 行测 定 3次烟 熏鲣 鱼样 品 ， 测定出的回收率结果见表 1 ， 回收率范围为 8 4 6 1 0 0 2 ， 相 对 标 准 偏 差 ( R S D) 范 围 为 1 0 0 6 1 2 ， 可见该 方法 精 密度 和 重现 性 较 好 ， 可 以满 足 烟熏 鲣鱼 中肌 苷酸 的检 测需 要 。 表 1 烟熏鲣鱼样品中肌苷酸的回收 率及其 RS D ( n= 3) Ta bl e 1 Re c o ve r i es a nd r e l a t i v e s t a nda r d d ev i at i o ns ( R S Ds) o f i n o s i n i c a c i d s p i k e d i n t h e S mo k e d Ka t s u wo n u s pe l a mi s ( n=3 ) 2 4两种 前处理 方 法的 比较 采用 1 3节所述两种前处理方法提取另一批次 烟熏鲣 鱼 中 的肌 苷 酸 ， 各 测 量 5组 数 据 ， 结 果 见 表 2 。从表 2可 以看 出 ， 以纯水 作 为 提 取 液 ， 测 定 的 烟 熏鲣鱼 中肌苷酸 的含量 为 1 4 8 g k g ， 而 以高氯酸 作 为提取 液 ， 测定 的含 量 为 1 0 8 g k g ， 纯 水 的 提取 效率 比高氯 酸 的 提取 效 率 要 高 3 7 0 。 由此 可 见 ， 纯水提取肌苷酸的效率要高于高氯酸提取 。 表 2 采用不同提取方法得到的烟熏 鲣鱼中肌苷酸 的含量 ( n= 5 J Ta bl e 2 Cont e nt s o f i n os i ni c a c i d i n Sm o ke d K at su wo nu s pe l a mi s b y d i ffe r e n t e x t r a c t i o n me t h o d s( a=5 ) 2 1 8 色 谱 第 3 0卷 3 结论 本 研 究采 用 9 5 的纯 水 提 取 烟 熏鲣 鱼 中 的肌 苷酸 ， 并 用 H P L C进 行 定 性 和定 量 分 析 。在 最 优 的 色谱条件下 ， 样品中的肌苷酸与杂质能够得 到很好 分离 ， 且峰形较好 ， 无拖尾现象 。该方法具有较高的 灵敏度。与高氯酸提取方法相 比， 提取效率增 加了 3 7 0 ， 并 且 该 方 法 操 作 安 全 、 与 环 境 友 好 ， 对 烟 熏 鲣 鱼 中肌苷 酸 的含 量 测 定 准 确度 良好 ， 对 其 他 食 品 中肌苷 酸含 量 的测 定 具 有 借 鉴 意 义 ， 是 一 种 值 得 推 广 的样 品预 处理 方 法 。 参 考文 献 ： 2 3 4 Wa n g X F，X u L X，Z h u G P J o u r n a l o f Bi o l o g y( 王学 畸， 许柳雄 ， 朱 国平 生物学杂志 ) ， 2 0 0 9 ， 2 6 ( 6 ) ： 6 8 W a ng Y M ，W u X L，Li Z J，e t a 1 Pe r i o di c a l o f Oc e a n Un i v e r s i t y o f C h i n a( 王玉 明，武晓琳 ， 李 兆杰 ，等中国海洋大 学学报 ) ， 2 0 1 1 ， 4 1 ( 1 2 ) ： 6 1 Z h a n g J T C h i n a B r e wi n g( 张京 涛中国酿造 )， 2 0 0 4 ( 3 )： 3 8 H e X， Y a n g R HC h i n a C o n d i me n t( 何 l圻，杨荣华 中国调 味 品) ， 2 0 0 5 ( 4) ： 3 5 Z h a n gH Y， Y u TY， Gu a nW J R e v i e w o f C h i n aAg r i c u l t u r a l S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y( 张海 艳，于 太永 ，关伟军 中国农 业科技导报 ) ， 2 0 0 4 ，6 ( 3 )： l 7 6 L i u X，Wa n g J ，Z h a n g W，e t a 1 Ma r i n e S c i e n c e( 刘旭 ，王 军，张纹 ，等海洋科学 ) ， 2 0 0 8， 3 2 ( 2 )： 2 2 7 L j n R X，Z h u C Q，Y a o S J o u rna l o f Z h e j i ang Un i v e r s i t y ( 林容轩 ，朱才铨 ，姚恕浙江大学学报 ) ，1 9 9 5 ，2 9 ( 6) ： 6 8 5 8 Xu S J ， Y u D B，D u W X B i o t e c h n 0 l 0 g y B u l l e t i n( 徐善 金 ， 虞德兵 ， 杜文兴 生物技术通报 ) ， 2 0 1 1 ( 3