花生四烯酸发酵动态代谢通量分析模型.pdf

亿 与 生 物 互 程 2 0 0 7 ， V o 1 2 4 N o 6 Ch e mis t r y & Bioe n gin e e r in g 花生 四烯 酸发 酵动态代谢通量分析模型 金 明杰 ， 黄和 ， 刘欣 ， 任 路 静 ， 张昆 ( 南京 工业 大学制 药 与生命 科 学 学院 ， 江 苏 南京 2 1 0 0 0 9 ) 摘 要 ： 分析 了高山被孢 霉发 酵生产花生四烯酸的动 力学特征 ， 建立 了氮源与 葡萄糖双底 物限制 动力 学模 型 ， 并结 合 代谢 流分析理论提 出了花生 四烯酸发 酵动态代 谢通量分析模 型 ， 通过非 线性 最 小二 乘法优化 拟合 获得 参数 。进 一步 实验表 明这个模 型具有较 高的精确度 ， 能很好地模拟发 酵过程 ， 并能很容 易地 获得 不同发 酵时间的代谢流分布。 关键 词 ： 动 态代谢通 量分析 ； 动 力学模型 ； 发酵 ； 花生四烯酸 中图分类号 ： T Q 9 2 0 1 文献标识码 ： A 文章编号 ： 1 6 7 2 5 4 2 5 ( 2 0 0 7 ) 0 6 -0 0 4 1 0 4 花生 四烯酸 ( Ar a c h i d o n i c a c i d ， AA) 属于 6 0 6系列 长链 多不饱 和 脂 肪 酸 ， 具 有 多 种 生 理 活 性 j ， 应 用 广泛 。微 生物 发酵 法生 产 AA 的研 究 主要集 中在 培 养基的优化 、 菌种的筛选和关键酶 等方面 ， 同时 氮源 充足 条件下 碳源 限制 发 酵过程 动力 学模 型 也 已建 立 ， 但 花生 四烯 酸 发 酵 过 程 的定 向调 控 一 直 是 个 难 题。代谢通量分析 ( MF A) 通过量化 细胞体 内的代 谢流 获得 代谢通 量分 布 图 ， 为 明确 细胞 内代 谢过 程 、 产 物合 成过 程提供 了可能 。 鉴 于 高 山被 孢霉 在氮 源受 限制 发 酵时 AA 产量 比 氮源 充足 时高 ， 同 时 目前 大 部分 发 酵 过 程都 采 用 限 制性氮 源发 酵 。 ， 作 者 在此 建 立 了氮 源 与碳 源 双底 物 限制 动力 学模 型 ， 并 进 一 步根 据 代 谢 通 量 分 析 理论 构建 了花生 四烯 酸 动态 代 谢 通 量 分 析模 型 ， 拟 为定 向 调 控发 酵过 程提 供依据 。 l 实 验 1 1菌种 和培 养基 高 山被孢 霉 ME 一 1 ( Mo r t i e r e l l a a l p i n e ME 一 1 ) ， 南 京工业 大学 代谢 工程实 验 室保存 。 种 子培 养 基 ( gL ) ： 葡 萄糖 6 0 ，酵 母 膏 5 0 ， KH2 P ( ) 4 3 0 ， p H 值 6 0 。 发 酵培 养 基 ( gL ) ： 葡 萄 糖 6 0 ，酵 母 膏 5 0 ， KH2 P O 3 0 ， Mg S O4 1 ， NA N( ) 3 3 ， p H 值 6 0 。 1 2发 酵工 艺 用 5 mI 无菌水 将 活化斜 面菌 种洗 入 装有 5 0 mL 田 种子 培养 基 的 2 5 0 mL三 角 瓶 中 ， 2 5 、 1 5 0 rmi n 下 摇瓶 培养 2 d得 种 子液 ， 接入 5 L发 酵罐 进 行发 酵 。 发 酵条 件 ： 温度 2 6 ， 搅 拌转 速 2 5 0 r mi n ， 装液 量 3 L， 通气量 2 0 L mi n ， p H 值 6 0 。 1 3分析 方法 糖 浓度 的测 定 ： S B A 生物 传感 分析 仪测定 。 菌 丝体 干 重的测 定 ： 将 培养 物 抽滤 ， 并 用 蒸馏水 洗 涤 3次 。抽 干 后 ， 6 0 烘 干 至 恒 重 ( 含 水 量 在 4 以 下 ) ， 称 重 。 菌油的提取 ： 索氏提取法提取粗菌油 。 脂肪酸测定 ： 参见文献E 1 2 。 菌体碳 、 氮元 素含量 的测定 ： 利用 E A l 1 1 2元素分析 仪测得 菌体 ( 不 含 油脂 ) 中 的碳 含 量 为 4 1 9 6 、 氮 含 量 为 5 9 6 。 发酵液氮元素 的衡算 ：发酵液氮浓度 一 发酵液 起始 氮 浓度 菌 体干重 5 2 双底物 限制动力学模 型的构建 花生四烯酸限制氮源发酵曲线如图 1 所示( 所提到 的菌体量都是扣除油脂后的) 。从 图 1可知 ， 菌体生长 存在一个迟滞期 ， 菌体生长加快氮源消耗也迅速加快， 随着氮源 的基本耗尽 菌体也停止 生长 ， 表 明氮 源浓度是 影 响菌体生 长 的限制 性 基质 。在 菌体 生 长 阶段 ( 0 9 6 h ) 葡萄糖基本是充足的， 同时其它条件( 如溶氧等) 对菌 体生长影响不大。而到了稳定期 ( 9 6 1 4 4 h ) 葡萄糖浓 度成 了限制 脂肪酸合成 的因素 。基于 以上分 析 ， 建立模 基金项 目： 江苏省 自然科学基金 资助项 目( B K 2 0 0 5 1 1 4 ) ， 江 苏省博士后科研 资助计 划项 目 收稿 日期 ： 2 0 0 7 0 3 3 0 作者 简介 ： 金 明杰( 1 9 8 1 一) ， 男， 江 苏吴 江人 ， 硕士 研 究生 ， 主要 研 究方 向： 代谢 工程 ； 通讯联 系人 ： 黄和 ， 教授 。E ma i l ：h u a n g h n j u t e d u C F I 。 维普资讯 囝 型如下 。 图 1 花生 四烯酸 限制氮源 曲线 F i g 1 T i me - c o u r s e s o f b i o ma k s a n d f a t t y a c i d s s y nt h esi s i n f e r me nt at i o n 2 1 氮 源受 限制菌 体 生 长及 氮 源 消 耗 动 力学 模 型 的 构建 选 择氮 源为 影响 菌 体 生 长 的唯 一 限 制性 基 质 ， 考 虑到菌 体浓度 的增 加对 自身 生长 的抑 制作用 及生 长存 在迟滞期 ， 采用 B e r g t e r 1 模型并略加修正 ， 建立 如下 生 长动 力学模 型 ： c 由于氮源只用来合成菌体 ， 因此氮源消耗动力学 模型 可用下 式表 示 ： 牟 一 一 0 0 5 ( 2 ) 2 2 碳 源 消耗动 力 学模 型 及 受碳 源浓 度 限 制 的 油脂 生成模 型 由于迟滞期、 指数生长期葡萄糖充足而稳定期葡 萄糖成 为脂 肪酸合 成 的 限制 条 件 ， 为 更 准 确地 描 述 脂 肪 酸 的合 成及 葡萄糖 的消耗 ， 对 迟 滞期 、 指数生 长期 与 稳 定期分别 用模 型描 述 。 用 L u e d e k i n g和 P i r e t L l 模 型来 描 述 葡萄 糖 的消 耗与菌体生长的关系如下 ： 一一锄 d c x 一 届f x ( 0 9 6 h ， 迟滞期 、 指数生长期) ( 3 ) 一一口 d c x 一 屈f x ( 9 6 1 4 4 h ， 稳定期) ( 4 ) 迟滞期 、 指数生长期葡萄糖充足 ， 对脂肪酸合成的 限制性影响不大 ， 并且脂肪酸的合成与菌体 生长部分 偶联， 因此用 L P方程描述这个时期脂肪酸的合成 ： dC P d t - b f + d c 稳 定期 菌体 生 长基 本 停 止 ， 脂 肪 酸 的合 成 相 当于 一 个酶催化转化过程 ， 且此 阶段葡萄糖浓度对脂肪酸 合成有 限制 性作 用 ， 因此选 择 Mi c h a e l i s 方 程描 述此过 程 ： 明杰等 ： 花生 四烯酸发酵动态代谢通 量分析模型 2 0 0 7年I i i 6期 dC p m g Cs 2 c 、 ( 6) 式 ( 1 ) ( 6 ) 构成 了花 生 四烯 酸发酵 双底 物 限制 的 动力 学模 型 。 3 基 于动力学模 型的动态代谢通量分析模型 3 1 代 谢通 量模 型的构 建 高山被孢霉体内 AA合成代谢 网络见 图 2 。在高 山被孢霉菌体内， 用于合成脂肪酸的 NAD P H 由苹果 酸 酶 ( Ma l i c e n z y me ) 脱 羧 作 用 即 转 氢 酶 循 环 ” 提 供 。 Gl u c o _r Bi 0m s s l N A D P H + c l ， ， 工 、 I 叫 -c 。 。 n z J 1 6 ： 0 -q8 ：0E n l o n g a s e Ar a c h i d o mc a c i d5 , 8 ， I I ， 1 4 - 2 0 ： 4 f AA ) 图 2高 山被孢霉体 内 A A合成代谢网络 Fi g 2 M e t ab o l i c pa t hwa y ne t wo r k of AA s y nt h esi s 根 据拟稳 态假设 ， 代 谢 中间物 的积 累为 零 ， 因此整 个代谢途径碳流的去路可用化学 计量反应式表示 ， 从 而构成 了 AA 发 酵代 谢通 量 的分析 模 型 。 ( 1 ) 经 过 E MP +T C A 循环 完全 氧化 的碳 流 ： l ：6 CO2 + 1 2 NADH + 4 ATP C6 Hl 2 O6 0 ( 2 ) 丙 酮酸 一草酰 乙酸 一苹果 酸 一丙酮 酸循 环“ 转 氢酶循环” ： r 2 ： 一 ATP NADH + NADPH= 0 将消耗的 NADH 和 ATP折算成完全通过 E MP +TC A循 环 消耗 的碳 流 ， 则 r 可表 示为 ： m 9 J 4 3 2O 1 O O O O O O O n 口 君 g u g u 0 u j 0 维普资讯 金明杰等： 花生四烯酸发酵动态代谢通量分析模 2 0 0 7年囊 6期 一 C6H1 2 U6 十 1 0NADPH 一 0 ( 3 ) 完全用于产 Ac C o A的碳 流， 即进入脂肪酸合 成 的碳 流 ： 。 。 。 。 P y m v 缸 e 。 A ：一 C 6 H1 2 O6 + 2 H2 0+ 2 NADH 一 2 ATP+ 2 NADPH + 2 Ac C o A+ 2 CO2 0 ( 4 ) 用于 菌体 生长 的碳 流 ， 作碳 元 素衡 算 ： d c x X 41 一 4 o ( G lu 表 示 用 于 菌 体 合 成 的葡萄糖分流浓度 ) 一 0 00 57 d c x ( 7) 3 2 基 于 动力学 模 型 的动 态 代 谢 通 量 分 析模 型 的构 建 指数 生 长期及 稳定 期脂 肪 酸组成 及 生成各 脂肪 酸 所 消耗 的 NAD P H 见 表 1 。经 衡算 脂肪 酸 中各 时期 碳 含量基本都为 7 6 。对 以上代谢 通量模 型做碳元素 衡算得 ： o 0 1 6 X ( 8 ) 四 4结果与讨 论 4 1动力 学模 型参数 的 求取 用 四阶 Ru n g e - Ku t t e 法求 解上 述微 分方 程 ， 用非 线 性最t - - 乘法优化拟合 得到动力学模型参数见表 2 。 表 2 动力学模 型参数 Tab 2 Pa r ame t e r s of k i n e t i c mo de l s d K t t 口 l 口 2 b d g m K p O 0 7 3 1 0 5 0 0 5 2 6 7 1 4 1 0 0 3 3 1 4 3 0 0 1 0 1 7 0 0 0 3 0 0 2 3 5 7 拟合效果见 图 3 ， c 、 c 计算值与实验值之 间 的 平 均 相 对 误 差 分 别 为 1 0 、 2 1 、6 8 、 1 4 ，拟合效果较好。 一 ：， +， +， 。 + 图 3模型拟合效果 图 对 NAD P H 做 衡算 ， 则 可得 ： F i g 3 c 。 m p 。 “ 。 。 p 。 m 。 m 。 d “ d t h o r 。 d r 一0 0 0 2 6 ( 迟滞 期和指数生长期) ( 9 ) 可将 稳定 期流 入脂 肪酸 的碳 流近 似看 作全 部 流入 AA合成 ， 对 NAD P H做衡算得 ： r 2 一O 0 0 3 3 X d C p ( 稳 定期) ( 1 0 ) 于是 有 n一一o 0 0 5 6 X d C s 2 r 2 - r 3一 l 1 ) 式( 1 ) ( 1 1 ) 便构成 了动态代谢 通量分析模 型。 求解 此模 型 可 获 得 任 意 时 间 段 ( 点 ) 的 r ， r 反 应 速 率 ， 继 而 归一化 便可 得到 代谢 通量 分布 图 ， 从 而 获得 发 酵过程中代谢通量动态变化数据。 表 1油脂 中各脂肪 酸含量以及合成各脂肪酸 N A D P H的消耗 Ta b 1 Co n t e n t of v ari o u s f a t t y a c i d s i n l i pi d s a nd c o s t s o f NADPH ， C o n t e n t o f v a r i o u s f a t t y a c i d s i n l i p id s 百 丽T百 _ i _ 9 6 2 7 1 7 1 2 6 5 8 5 2 O 5 2 2 O 1 2 1 1 6 8 1 5 5 4 0 1 7 6 5 0 1 0 5 0 4 5 0 3 0 C o s t s o f NA D P H 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 O 1 7 mo I m o l 一 4 2 模 型 的验 证 为 了验证模型的误差 ， 对另一组实验数据 与模型 预测值 进行 比较 ， 结 果 见 图 4 。C 、 C 、 C 、 C 计 算 值 与 实验值 之 间 的 平 均 相 对 误 差 分 别 为 2 1 9 6 、 4 4 、 1 2 、 3 4 ， 说 明该 模 型 能 很 好 地 描 述 氮 源 受 限 制 发 酵过 程 。 图 4实 验数 据 与 预 测 值 的 比 较 Fi g 4 Co m pa r i s o n o f e x p e r i m e nt al da t a a n d p r e d i c t e d da t a 4 3代 谢流 量分 布探 讨 通过动态代谢通量分析模型计算得到菌体发酵过 程典型生长期第 4 8 h的 r ， r 速率， 归一化后得到代 谢 流分 布 图( 图 5 ) 。从 图 5很 明 显地 可 以看 出 ， 要 提 ， 0 是g耸8 s p 【d I 1 萋 0 西 O O 0 O O O ) 。 -0 们 _ 宣0 口是 最 u g u o 。 Z 雌 们 _ 1 ， u 0 是 8 g 2j 0 。 Z 维普资讯 圈 高脂肪 酸 的产量 就得 调 控代 谢 流 在 菌体 生 长 、 三 羧 酸 循环和脂肪酸合成中的分配 ， 在保证 细胞正常运转 的 情况下将流人三羧酸循环的代谢流降到最低 ， 而将 流 人脂 肪 酸合成 的代谢 通量 调至最 高 。因此 如何 限制 三 羧酸循 环 的活性 、 引 导代 谢 流 向脂 肪 酸 合 成迁 移 是 调 控花生 四烯 酸发 酵 的重 点 。 4 3 删 Bi o S s Lip i d s l288 5 结 论 图 5 4 8 h时点的代谢 流分 布 Fi g 5 Fl u x di s t r i b ut i o n at 48 t h h ou r 建 立 了氮源 与葡 萄 糖 双底 物 限 制 动力 学 模 型 ， 在 此基础上结合代谢流分析理论提出了花生四烯酸发酵 动态代谢通量分析模型， 并通过非线性最 小二乘法拟 合获 得参 数 。该 模 型能 很 好 地模 拟 发 酵 过 程 ， 并 且 能 很容 易地 获得 不 同发酵 时间 的 代谢 流 分 布 ， 为 指 导 花 生 四烯 酸发 酵调 控 、 探 讨 代 谢 网 络 刚柔 节 点 以 及探 究 代谢机理提供了依据。 符号说明 ： c 。 ： 油脂浓度 ， g L - 。t ： 时间 ， h c “ 氮源浓度 ， g L _ 。t 延滞期时间 ， h c ： 葡萄糖浓度 ， g L c ： 菌体浓度( 不包含油脂 ) ， gL K。 ： 油脂形成 动力学常数 ， g L ：最 大比油脂 生成速率 ， h ：菌体 的最大 比生长速率 ， h r 1 、 r 2 、 r 3 、 ： 反应速率 ， m mo l g h K ， a ， 们， 9 1 ， 口 ， ， b ， d： 模型参数 参 考 文 献 ： 1 C a r l s o n S E L o n g - c h a i n p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s a n d d e v e lo p me n t o f h u ma n i n f a n t I- j Ac t a P a e d i a t r i c S u p p l e me n t ， 1 9 9 9 ， 8 8 ( 4 3 0 )： 7 2 7 7 明杰等 ： 花生四烯酸发酵动态代谢通量分析模型 2 0 0 7年一 6霸 E 2 3 Me y d a n i MMo d u l a t io n o f t h e p l a t e l e t t h r o mb o x a n e A 2 a n d a o r t i c p r o s t a c y c l i n s y n t h e s i s b y d i e t a r y s e l e n i u m a n d v i t a mi n E J 3 Bio l Tr a c e El e m Re s ， 1 9 9 2，3 3： 7 9 8 6 3 Va n d e r Z e e L，Ne l e ma n s A，D e n He r t o g AAr a c h i d o n i c a c i d i s f u nc t i o n i n g a s a s e c o n d me s s e n ge r i n a c t i v a t i n g t h e Ca e n t r y p r o c e s s o n H 1 一 hi s t a m ino c e p t o r s t i mu l a t i o n i n DDT1 M F一 2 c e l l s J B i o c h e m J ，1 9 9 5， 3 0 5 ( P t 3 ) ： 8 5 9 8 6 4 4 汪志明 花生 四烯酸生产及应用 J 中国食品添加 剂， 2 0 0 1 ， ( 1 ) ： 3 0 3 3 5 3 周蓬蓬 ， 余 龙江 ， 吴元喜 ， 等 高山被孢霉 产花生 四烯酸发酵 条件 的研究F J 工业微生物，2 0 0 3 ，3 3 ( 2 ) ： 4 卜4 5 6 S a k u r a d a n i E，Hi r a n o Y，Ka ma d a N，e t a 1 I mp r o v e me n t o f a r a e h i d on i e a c i d p r o du c t ion b y mu t a n t s wit h l o we r n 一 3 d e s a t u r a t io n a c t i v i t y d e r i v e d f r o m Mo r t i e r e l l a a l p i n a 1 S - 4 J Ap p l i e d M i c r o b i o l o g y a n d Bi o t e c h n o l o g y ，2 0 0 4，6 6 ( 3 )： 2 4 3 2 4 8 ， 7 3 Wy n n J P ，R a t l e d g e C E v i d e n c e t h a t t h e r a t e - l i mi t i n g s t e p f o r t he b i o s y n t h e s i s o f a r a c h i d o n i c a c id i n M o r t i e r e l l a a l pi n e i s a t t h e l e v e l o f t h e 1 8：3 t o 2 0：3 e l o n g a s e J Mi c r o b i o l o g y ，2 0 0 0 ， 1 4 6( 9 )： 2 3 2 5 2 3 3 1 8 3 鲍时 翔， 朱 法科 ， 林炜 铁 ， 等 花 生 四烯 酸发 酵过 程 动力 学模 型 J 化工学报 ，1 9 9 7 ，4 8 ( 3 ) ： 3 0 0 3 0 3 9 B a i l e y J ET o wa r d a s c i e n c e o f me t a b o l i c e n g i n e e r i n g J S c i e n c e ，1 9 9 1 ， 2 5 2( 5 01 3 )： 1 6 6 8 1 6 7 5 1 o 3 Wy n n J P，Ha mi d A A，R a t l e d g e C， e t a 1 B i o c h e mi c a l e v e n t s l e a d i n g t o t h e d i v e r s ion o f c a r bo n i n t o s t o r a g e l i pids i n t h e o l e a g i n o u s f u n g i Mu c o r c i r c i n e l l o i d e s a n d Mo r t i e r e l l a a l p i n e J Mi c r o b i o l o g y，2 0 01 ， 1 4 7( 1 0 )： 2 8 5 7 2 8 6 4 1 1 3贡国鸿 ，尚耘 ， 高 翔， 等微 生物 发酵 法 生产 花生 四烯 酸油 脂 J 中国油脂 ，2 0 0 2 ， 2 7 ( 1 ) ： 4 3 4 4 1 2 3 黄和 ， 李学坤 ， 张 昆 ， 等应用尿素包 合法提 纯花生 四烯 酸 J 化学与生物工程 ， 2 0 0 6 ，2 3 ( 4 ) ： 2 9 3 1 1 3 3 Go r i n P A， B e r g t e r J B T h e p o 1 y s a c c h r i d e s J Ne w Y o r k ； Ac a d e mi c P r e s s ， 1 9 8 3： 4 1 2 - 49 0 1 4 L u e d e k in g R， P i r e t E I A k i n e t i c s t u d y o f l a c t i c a c i d p r o d u c t i o n c ou p l i n g f o r La c t o b a c i l l u s h e l v e t i c u s c u l t i v a t e d o n s u p p l e me n t e d wh e y ： I n f l u e n c e o f p e p t i d i c n i t r o g e n d e f i c i e n c y J J B i o c h e m M i c r o b i o l Te c h n o l En g，1 9 5 9，1 ( 4) ：3 9 3 41 3 1 5 3 马正飞， 殷翔 数学计算方法与 软件 工程应用 M 北京 ： 化学工 业 出 版 社 ， 2 0 0 2 ：1 3 7 - 1 7 1 Dy na mi c Fl u x An a l y s i s M o d e l f o r Ar a c hi d o ni c Ac i d Fe r me n t a t i o n J I N Mi n g - j i e ， HU A NG He ， L I U X i n ， R E N L u - j i n g ，Z HA N G Ku n ( C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e a n d Ph a r ma c e u t i c a l En g i n e e r