刺梨不同提取部位对人类肝癌细胞株(HepG2)胆固醇代谢的影响.pdf

第 3 2卷第2 期 2 0 0 7年 1月 中 国 中 药 杂 志 Ch i n a J o u r n a l o f Ch i n e s e Ma t e r i a Me d i c a Vo 1 3 2，I s s u e 2 J a n u a r y 。2 0 0 7 刺梨不同提取部位对人类肝癌细胞株( H e p G 2 ) 胆固醇代谢 的影响 吴水生， 郭改革 ， 王 宏 ， D a v i d L e e ( 1 福建中医学院 药学系， 福建 福州 3 5 0 0 0 3 ； 2 B i o o r g a n i c a n d N a t u r a l P r o d u c t L a b 。 Mc l e a n H o s p i t al， H a zard Me d i c a l S c h o o l ， MA，U S A 0 2 4 7 8 ) 刺梨 R o s a r o x b u r g h i i T r a t t 为蔷薇科属野生植 物， 用于治疗积食腹胀、 肠炎痢疾 、 维生素 c缺乏症 等。刺梨含维生素 c 、 维生素 E 、 超氧化物歧化酶 ( S O D ) 、 多糖， 以及 卢 谷甾醇、 原儿茶酸、 委陵菜酸、 e u s c a p h i c a c id 、 硬脂酸和廿一烷酸等成分。具有 清除自由基、 增强机体免疫力、 防动脉粥样硬化、 抗 细胞突变和抗癌等药理作用 ， 此外还有明显的降 血脂作用 j 。本实验以人类肝癌细胞系 H e p G 2为 模型， 测定刺梨各部位对细胞胆固醇合成与代谢的 影响， 以筛选刺梨降血脂作用有效成分或有效部位， 为进一步开发刺梨降血脂药用部位奠定基础。 1 材料与方法 1 1 材料 H p it o r 标准品( S i g m a 公司) ； S y n e r g y H T酶标 仪( M i c r o T e k 公司) 。 1 2 试药制备 干燥刺梨果粉碎成2 O目左右的粗粉， 皮肉与果 核同用。 1 - 2 1 水提物制备称取一定量刺梨粉， 分别加入 8 ， 6倍量的水， 各煎煮 1 h ， 过滤， 合并 2次煎液， 浓 缩成浸膏， 真空冷冻干燥成干粉备用。 1 2 2 系统提取物制备称取一定量刺梨粉， 加入 6 倍量正已烷， 超声提取 4 5 ra i n ， 过滤， 再加入等量 溶剂超声 4 5 m i n ， 合并 2次提取溶剂， 回收挥干溶 剂。加热药渣挥去溶剂后再加入下一梯度溶剂， 做 法同上。分别制得正已烷 、 醋酸乙酯、 丙酮、 甲醇和 水刺梨提取物， 真空冷冻干燥备用。 1 2 3甲醇提取物的 D i a i o nH P 2 0分离纯化取 刺梨甲醇提取物适量， 用水适量溶解， 上载到已经制 备好的D i a i o n H P 2 0树脂上， 先用水洗脱到无色， 再改用 2 5 ， 5 0 ， 7 5 ， 1 0 0 甲醇分别洗脱， 得 收稿日 期】 2 0 0 6 1 0 一 1 0 通讯作者】 吴水生， T e l ： ( 0 5 9 1 ) 2 2 8 6 1 1 3 5 ， E - m a i l ： w s s t c m y a h o o c o rn， e l l 1 7 0 到上述 5 个部位， 挥干溶剂， 真空冷冻干燥备用。 1 2 4 细胞培养试药的制备准确称取一定量的 上述各已经制好备用的提取物， 以 D M S O溶解配制 成以 m g m L 为单位的贮存液， 再用不含脂蛋白 的D M E M液稀释配制成不同浓度的工作液( D M S O 终浓度0 1 ) ， 无菌过滤备用。对照药 L i p i t o r 则配 成 3 m m o L 的贮存液备用。 1 3 细胞培养与制备 H e p G 2 细胞购 自美国 A T C C( H B -8 0 6 5 ) ， 用含 有 1 0 的胎牛血清 F B S ( S ig m a ) 的 D M E M( C e l l G m， 1 5 - 0 1 3 - C V ) 做培养基， 种植于6孔培养板内置于3 7 c 【= 的 C O ： 培养箱内； 待细胞长至合适密度后， 吸去上 清液， 用 P B S 清洗2次， 分别加入 1 2 m L的上述试 验用药工作液 ， 对照组则加空白 D M E M液； 培养 2 4 h 后收取 1 m L的培养液供测定培养液内的胆固醇 含量； 然后吸除剩余的培养液， 用 P B S清洗 2次； 加 入 1 2 0 L的R i p a B u ff e r 于各孔内， 轻轻振摇， 2 3 m i n 后用 1 m L的t ip头轻刮盘底， 使细胞脱落与溶 解 ， 吸取细胞溶解液， 置于 一 2 O冰冻保存备用。 1 4 细胞毒性与活性测定 分别选用基于细胞内酯酶活性及胞膜完整性原 理的L i v e D e a d 试剂盒 ( M o l e c u l a r P r o b e s ， L - 3 2 2 4 ) 及反应活细胞线粒体代谢活性的 A la m a r b l u e T M 试剂 盒( B i o S o u r c e ， D A L 1 1 0 0 U S A) ， 测定程序分别按说 明书方法操作， 以酶标仪测定。 1 5 胆固醇含量测定 按试剂盒 A m p l e x ( M o l e c u l a r P r o b e s ) 的说明书 程序， 胆 固醇标准曲线质量浓度为 0 ， 0 5 ，1 0 ， 2 0 ， 4 0 ， 8 + 0 g m L 。吸取细胞溶解液 2 O L ， 加入 R i p a B u ff e r 1 0 0 I L L ， 稀释6 倍以供测定。 1 6 蛋白质含量测定 用蛋白质含量测定试剂盒( B i o - R a d )测定。蛋 白质标准曲线质量浓度分别为 0 ， 0 1 ， 0 + 5 ，1 0 ， 1 5 Ix g m L 。吸取细胞溶解液 5 L ， 加入 2 O L 维普资讯 第3 2 卷第 2 期 2 0 0 7年 1月 中 国 中 药 杂 志 Ch i n a J o u r n a l o f Ch i n e s e Ma t e r i a Me d i c a Vo 1 3 2，I s s u e 2 J a n u a r y，2 0 0 7 的 R ip a B u ff e r ， 稀释4倍以供测定。 1 7 统计处理 所有数值以 4 - s 表示， 以 检验或，检验判断 两组或多组之间的差异显著性。 2 结果 2 1 对细胞的毒性及代谢活性的影响 刺梨水提物分别以0 ， 1 ， 5 ， 1 0 m g m L 加入 已经长至一定密度的 H e p G 2细胞 9 6孔培养板内， 置 c 0 。 培养箱内孵育 2 4 h 后， 按试剂盒测定方法步 骤操作。结果当质量浓度达 1 0 m g m L 时， 细胞 活性有所降低， 为( 9 2 3 5 ) ， 故实验用药质量浓 度初拟为0 ， 0 5 ， 1 ， 5 m g- m L 。 2 2 对胆固醇含量的影响 在实验的不同阶段， 以 D M S O为溶剂制备各个 试验用药， 分别以0 ， 0 5 ， 1 0 ， 5 0 m g m L 4个 质量浓度加药。经过对 L ip it o r 不同剂量的实验对 比， 最后确定 L i p i t o r以3 Ix m o l L 浓度为阳性对 照剂量。具体测定方法按试剂盒方法操作， 分别测 定了培养液及细胞内胆固醇的含量， 单位以每毫克 蛋白质含胆固醇计算( g m g ) 。结果分别见表 1和表 2以及图 1 。 表 1 不同刺梨水提物对 H e p G 2 细胞胆固醇代谢 的影响( s ) 表2 不同浓度的各种溶剂刺梨提取物对 H e p G 2细胞胆固醇代谢的影响( 牙 s ) 3 讨论 实验证实了刺梨在细胞层次上的降低胆固醇含 量的作用， 为刺梨降血脂新药的开发提供了基础。 实验结果显示了刺梨水提物的明显降 H e p G 2 细胞内胆固醇作用， 而且存在良好的量效关系， 其降 胆固醇幅度比阳性对照药 L i p i t o r 还大。如此好的 结果， 令人产生是否存在假阳性的可能。因为本 图 1 刺犁甲醇提取物 D i a i o n H P 2 0 树脂不同洗脱部位 对 H e p G 2细胞内胆固醇代谢的影响 实验所用胆固醇测定试剂盒 A m p l e x 定原理中 涉及到氧化还原反应， 为了排除刺梨中所含抗氧化 剂对实验结果造成的影响， 通过空白试验、 培养液中 直接加入试验用药及加药培养细胞液等测定发现刺 梨提取物确实能提高胆固醇测定数值， 而且呈现极 明显的量效关系， 即随着用药量的增大所测定的胆 固醇值显著升高。因此， 证 明了刺梨提取物降低 H e p G 2 细胞内胆固醇含量确实是其作用于细胞内 的胆固醇合成或者代谢的结果， 而非所用试药对测 定试剂直接影响而造成的假阳性。 在肯定了刺梨水提物的降低胆固醇作用后， 进 行了系统溶剂的提取 ， 从所得到的正已烷、 醋酸乙 酯、 丙酮、 甲醇、 水提取物的降胆固醇效价试验中发 现， 以甲醇提取物的降胆固醇效价最高， 所以针对刺 梨甲醇提取物部分进行了更进一步的分离与纯化。 考虑到刺梨中的主要有效成分偏于水溶性的， 故此 选择了 D i m o n H P一2 0型树脂， 用不同浓度的甲醇 来进行洗脱， 得到了水， 2 5 ， 5 0 ， 7 5 ， 1 0 0 甲醇 洗脱等5个部位。细胞培养试验表明， 其中以5 0 甲醇洗脱部分的降胆固醇作用效价最高。5 0 甲醇 洗脱部位的化学成分分析与鉴定正在进行中。 参考文献 1 魏 明山 刺 梨 果化 学 成分 研 究 J 中 国野生 植 物 ， 1 9 9 1 ， ( 3 ) ： 1 2 王薇 ，夏炳南 ， 刺 梨 的研 究进 展 J 中 国药 学杂 志 ， 1 9 9 6， 3 1 ( 1 1 )： 6 4 3 3 吴立夫， 杨履端 刺梨汁的降血脂作用 J 贵州农学院学 报， 1 9 9 2 ， 1 1 ( 1 ) ： 8 9 4 3 戴尧天， 张 昭 刺梨