固定化酶和固定化细胞技术.pdf

张 海 龙 山东教育学院 生物系 Shan Dong Institute of Education 第九章 第九章 第九章 第九章 固固固固定定定定化酶与固定化细化酶与固定化细化酶与固定化细化酶与固定化细 胞技术胞技术胞技术胞技术 第一节第一节第一节第一节 固定化酶固定化酶固定化酶固定化酶 固定化酶：是指在在一定空间内呈闭锁状 态存在的酶，能连续地进行反应，反应后 的酶可以回收重复利用。 酶的固定化是将酶与水溶性载体结合，制 备固定化酶的过程。 （1）极易将固定化酶与底物、产物分开，产物溶液中没 有酶的残留，提纯工艺简化； （2）能够在较长时间 进行反应，便于实现连续化和自动 化； （3）大多数情况下，能够提高酶的稳定性； （4）酶的反应过程能够严格控制； （5）酶的利用率提高，生产成本降低； （6）能够进行多酶反应； （7）可以增加产物收率，提高产物的质量； （8）增加了生产的成本； （9）只能用于可溶性小分子底物，对大分子的底物适应 性差，与完整的菌体细胞相比，不适宜于多酶反应，特别 是需要辅助因子的反应。 固定化酶的特点（与游离酶相比）固定化酶的特点（与游离酶相比） 根据不同应用目的和不同应用环境选择不同的方 法，遵循如下原则： （1）必须维持酶的催化活性以及专一性； （2）有利于实现连续化和自动化； （3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶 与底物的接近，以便提高产品的质量； （4）酶与载体必须结合牢固，便于回收贮存，反复利 用； （5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不应与产 物或反应液发生化学反应； （6）成本要低，以便于工业使用； 一、固定化酶的制备方法一、固定化酶的制备方法 （一）包埋法： 1、网格型 2、微囊型：界面沉淀法、界面聚合、二级乳化法、脂质包埋法 （二）吸附法： 1、物理吸附法 2、离子吸附法 （三）、共价偶联法 （四）、交联法 （五）、共价结合法 1、结晶法 2、分散法 实践中，可根据酶的性质，反应特征选择合适的方法。实践中，可根据酶的性质，反应特征选择合适的方法。 酶固定化方法示意图酶固定化方法示意图酶固定化方法示意图酶固定化方法示意图 1 1 1 1、稳定性、稳定性、稳定性、稳定性 2 2 2 2、最适温度最适温度最适温度最适温度 3 3 3 3、最适最适最适最适pHpHpHpH 4 4 4 4、底物特异性底物特异性底物特异性底物特异性 go 二、固定化酶的性质二、固定化酶的性质 稳定性稳定性稳定性稳定性 比游离酶的好比游离酶的好比游离酶的好比游离酶的好 （1 1 1 1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度 0 0 2020 4040 6060 8080 100100 3030404050506060707080809090 Temperature ( C )Temperature ( C ) Relative activity (%)Relative activity (%) A A B B A A A A固定化酶固定化酶B B B B游离酶游离酶 稳定性稳定性稳定性稳定性( ( ( (续续续 续) ) ) ) （2 2 2 2）保存稳定性好，保存时间延长）保存稳定性好，保存时间延长）保存稳定性好，保存时间延长）保存稳定性好，保存时间延长 （3 3 3 3）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白 （4 4 4 4）对变性剂）对变性剂）对变性剂）对变性剂( ( ( (如尿素、有机溶剂、盐酸胍等如尿素、有机溶剂、盐酸胍等如尿素、有机溶剂、盐酸胍等如尿素、有机溶剂、盐酸胍等) ) ) )的的的的 耐受性提高，保留较高酶活耐受性提高，保留较高酶活耐受性提高，保留较高酶活耐受性提高，保留较高酶活 （5 5 5 5）对酶抑制剂、对不同）对酶抑制剂、对不同）对酶抑制剂、对不同）对酶抑制剂、对不同pHpHpHpH稳定性提高稳定性提高稳定性提高稳定性提高. . . . ( ( ( (backbackbackback) ) ) ) 最适温度最适温度最适温度最适温度 与游离酶差不多与游离酶差不多与游离酶差不多与游离酶差不多 0 0 5050 100100 150150 200200 250250 300300 350350 303040405050606070708080 Temperature ( C )Temperature ( C ) Relative activity (%)Relative activity (%) A A B B 最适温度最适温度最适温度最适温度( ( ( (续续续续) ) ) ) 例外例外例外例外 用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶， 比游离酶高比游离酶高比游离酶高比游离酶高5-105-105-105-10; ; ; ; 以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高以共价结合法固定的色氨酸酶，比游离酶高5-15 5-15 5-15 5-15 汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为 80 80 80 80 ，比固定化前提高了，比固定化前提高了，比固定化前提高了，比固定化前提高了30 30 30 30 同一种酶同一种酶同一种酶同一种酶; ; ; ; 用不同的方法或载体进行固定化，其最适温度可能用不同的方法或载体进行固定化，其最适温度可能用不同的方法或载体进行固定化，其最适温度可能用不同的方法或载体进行固定化，其最适温度可能 不同不同不同不同 不同方法和载体固定化氨基酰化酶的最适温度不同方法和载体固定化氨基酰化酶的最适温度 60 60 60 60烷基化法烷基化法烷基化法烷基化法DEAE-DEAE-DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 67 67 67 67离子键结合法离子键结合法离子键结合法离子键结合法DEAE-DEAE-DEAE-DEAE-纤维素纤维素纤维素纤维素 72 72 72 72离子键结合法离子键结合法离子键结合法离子键结合法DEAE-DEAE-DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 60 60 60 60游离游离游离游离 最适温度最适温度最适温度最适温度( ( ( ( ） 方法 载体载体载体载体 最适最适最适最适pHpHpHpH值值值值 酶固定化后，对底物作用的最适酶固定化后，对底物作用的最适酶固定化后，对底物作用的最适酶固定化后，对底物作用的最适pHpHpHpH和酶和酶和酶和酶pHpHpHpH曲线常发生偏曲线常发生偏曲线常发生偏曲线常发生偏 移（见图），原因是微环境表面电荷性质的影响移（见图），原因是微环境表面电荷性质的影响移（见图），原因是微环境表面电荷性质的影响移（见图），原因是微环境表面电荷性质的影响 带负电荷的载体，带负电荷的载体， 固定化酶最适固定化酶最适pHpHpHpH值值 比游离酶的高比游离酶的高 (1)(1)(1)(1)载体的带电性质对最适载体的带电性质对最适pHpHpHpH的影响的影响 原因原因: : : :吸引作用吸引作用 带正电荷的载体，带正电荷的载体， 固定化酶最适固定化酶最适pHpHpHpH值值 比游离酶的低比游离酶的低 H+ + + + H+ + + + H+ + + + H+ + + + H+ + + + H+ + + + H+ + + + 偏酸微偏酸微 环境环境 OHOHOHOH- - - - OHOHOHOH- - - - OHOHOHOH- - - - OHOHOHOH- - - - OHOHOHOH- - - - OHOHOHOH- - - - H+ + + + H+ + + + 大环境偏碱大环境偏碱 酶酶 不带电荷的载体，固定化酶最适不带电荷的载体，固定化酶最适pHpHpHpH值一般不变值一般不变 (2)(2)(2)(2)产物酸碱性对最适产物酸碱性对最适pHpHpHpH值的影响值的影响 酸性酸性酸性酸性: : : :固定化酶的最适固定化酶的最适固定化酶的最适固定化酶的最适pHpHpHpH值比游离酶的高值比游离酶的高值比游离酶的高值比游离酶的高 碱性碱性碱性碱性: : : :固定化酶的最适固定化酶的最适固定化酶的最适固定化酶的最适pHpHpHpH值比游离酶的低值比游离酶的低值比游离酶的低值比游离酶的低 中性中性中性中性: : : :固定化酶的最适固定化酶的最适固定化酶的最适固定化酶的最适pHpHpHpH值一般不变值一般不变值一般不变值一般不变 原因原因原因原因: : : :载体障碍产物的扩散载体障碍产物的扩散载体障碍产物的扩散载体障碍产物的扩散 底物的特异性底物的特异性底物的特异性底物的特异性 与底物分子量的大小有关与底物分子量的大小有关与底物分子量的大小有关与底物分子量的大小有关; ; ; ; 作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基 酰化酶、葡聚糖氧化酶等酰化酶、葡聚糖氧化酶等酰化酶、葡聚糖氧化酶等酰化酶、葡聚糖氧化酶等; ; ; ; 既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的 酶，往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上酶，往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上酶，往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上酶，往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上 的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对 酶蛋白的作用仅为游离酶的酶蛋白的作用仅为游离酶的酶蛋白的作用仅为游离酶的酶蛋白的作用仅为游离酶的3%3%3%3%左右左右左右左右 原因原因原因原因: : : :载体的空间位阻作用载体的空间位阻作用载体的空间位阻作用载体的空间位阻作用 固定化酶制备物性质取决于所用的酶及载体材料的固定化酶制备物性质取决于所用的酶及载体材料的固定化酶制备物性质取决于所用的酶及载体材料的固定化酶制备物性质取决于所用的酶及载体材料的 性质性质性质性质 (1)(1)(1)(1)酶固定化后的变化主要是活性中心的氨基酸残基、酶固定化后的变化主要是活性中心的氨基酸残基、酶固定化后的变化主要是活性中心的氨基酸残基、酶固定化后的变化主要是活性中心的氨基酸残基、 高级结构和电荷状态等发生变化高级结构和电荷状态等发生变化高级结构和电荷状态等发生变化高级结构和电荷状态等发生变化 (2)(2)(2)(2)载体影响主要是在固定化酶的周围形成了能对底载体影响主要是在固定化酶的周围形成了能对底载体影响主要是在固定化酶的周围形成了能对底载体影响主要是在固定化酶的周围形成了能对底 物产生立体影响的扩散层及静电的相互作用等引起物产生立体影响的扩散层及静电的相互作用等引起物产生立体影响的扩散层及静电的相互作用等引起物产生立体影响的扩散层及静电的相互作用等引起 的变化的变化的变化的变化 三、影响固定化酶性能的因素三、影响固定化酶性能的因素 第二节第二节第二节第二节 辅酶和辅基的固定化辅酶和辅基的固定化辅酶和辅基的固定化辅酶和辅基的固定化 一、辅酶的固定化一、辅酶的固定化一、辅酶的固定化一、辅酶的固定化 二、辅酶的再生二、辅酶的再生二、辅酶的再生二、辅酶的再生 三、辅基的固定化三、辅基的固定化三、辅基的固定化三、辅基的固定化 第三节第三节第三节第三节 细胞的的固定化细胞的的固定化细胞的的固定化细胞的的固定化 固定化细胞就是被限制自由移动的细胞， 既细胞受到物理化学等因素约束或限制在 一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活 性并具备能被反复或连续使用的活力。是 在酶固定化基础上发展起来的一项技术。 固固固固定化细胞的优点定化细胞的优点定化细胞的优点定化细胞的优点 1，与游离细胞相比 固定化细胞可以将微生物发酵改为连续酶反应 可以获得更高的细胞浓度； 细胞可以重复使用； 在高稀释率时，不会产生洗脱现象； 单位容积的产率高； 提高遗传稳定性； 细胞不会受到剪切效应的影响。 发酵液中菌体含量少，有利与产品的分离纯化。 2，与固定化酶相比 免去了破碎细胞提取酶的手续 酶在细胞内的稳定性较高，完整细胞固定化后 酶活性损失少 固定化细胞制备的成本比固定化酶低 无需辅酶再生 固固固固定化细胞的缺点定化细胞的缺点定化细胞的缺点定化细胞的缺点 仅能利用胞内酶； 细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用； 载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性； 可能有副反应。 一、一、一、一、固定化细胞的分类固定化细胞的分类固定化细胞的分类固定化细胞的分类 1，按细胞类型分为三类： 微生物 动物 植物 2，按生理状态分为两大类 死细胞： 完整细胞、细胞碎片、细胞器。 适用于一种酶催化的反应。 活细胞： 增殖细胞、静止细胞、饥饿细胞。 适用于多酶反应，特别是需要辅酶 的反应。 3、形状 固定化细胞由于其用途和制备方法不同， 可以是颗粒状、块状、条状、薄膜状或不 规则状等。但目前大多数制备成颗粒状珠 体。 二、细胞固定化的制备二、细胞固定化的制备二、细胞固定化的制备二、细胞固定化的制备 固定化酶和固定化细胞的方法都是以酶的 应用为目的，其制备方法和应用方法也基 本相同。固定化完整细胞的每种方法都有 其优缺点。对于特定的应用，必须找到价 格低廉、简单的方法，高活力的的保留和 操作稳定性，后两者是评价固定化生物催 化剂的先决条件。 三、固定化细胞的性质三、固定化细胞的性质三、固定化细胞的性质三、固定化细胞的性质 （一）、目的产物的产量提高 （二）、克隆基因产物的表达 （三）、质粒的遗传稳定性 四、培养条件对质粒稳定性、菌体量及克四、培养条件对质粒稳定性、菌体量及克四、培养条件对质粒稳定性、菌体量及克四、培养条件对质粒稳定性、菌体量及克 隆基因产物的影响隆基因产物的影响隆基因产物的影响隆基因产物的影响 1、接种量 2、固定化颗粒数量 3、介质浓度 4、营养物质 5、培养温度及PH值 6、溶解氧浓度 第四节第四节第四节第四节 评价固定化酶生物催化剂的指标评价固定化酶生物催化剂的指标评价固定化酶生物催化剂的指标评价固定化酶生物催化剂的指标 一、固定化酶活力一、固定化酶活力 与其溶液酶相比，大多数固定化酶活性下降。固定化酶 活力下降的原因主要有：酶与不溶性载体相结合引起结构发 生了变化；酶活性中心的重要氨基酸残基与裁体相结合。这 两者造成的酶活力下降可以适当条件加以克服。载体与酶结 合后，酶虽不失活，但酶与底物间的相互作用受到空间位 阻，从而使活力下降。这个影响难以克服。另外，在包埋法 中，酶活性的下降可能是在酶的固定过程中有变性所致。 酶固定化效果的测定 固定化酶活力测定基本上与溶液 酶相似，也以反应初速度表示即每毫克干重固定化酶每分 钟转化1umol底物量或形成1umol产物的酶量为一个单位 (umol/mgmin)，对于酶管、酶膜、酶板等，则以单位面积 （cm2）的初速度来表示。 由于在偶联反应中酶往往会有些失活，因此，测定残 留活力还不能正确反映与载体结合的酶活力，所以，仍以测 定蛋白量较为难确。在酶固定化操作中，当酶与载体结合 后，用适量适当的缓冲液淋洗固定化酶，以洗除未固定的 酶，收集洗脱液，并测定其中蛋白量(或酶活力)，即为残留 的蛋白量(或酶活力)。 偶联效率 偶联效率以载体结合酶量(或酶活力)的百分数表示： 二、偶联率及相对活力的测定二、偶联率及相对活力的测定 活力回收和相对活力 酶固定化般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶 液酶活力的百分数称为活力回收。 第五节 固定化细胞的应用 抗生素的生产 有机酸的生产 氨基酸的生产 酶制剂的生产 生物转化 废水处理 基因工程菌的固定化 一、抗生素的生产 抗生素是次级代谢产物，属非生长关联 型，以游离细胞采用连续发酵很难生产抗 生素。 抗生素的发酵为非生长关联型，因此生长 和代谢产物合成阶段所需的营养条件不同。 从理论上，阻止固定化细胞的增殖是可能 的，因而可以使用较稀的培养基来连续合 成抗生素。 二、有机酸的生产 柠檬酸是有机酸中的主要品种，柠檬酸一 般是以黑曲霉为菌种来生产。在发酵过程 中，由于菌体的生长，导致发酵液粘度的 上升，会影响氧的传递。而采用固定化细 胞技术，由于生长被抑制，因而不会影响 氧的传递。 三、氨基酸的生产 例如固定化Escherichia coli