次黄嘌呤核苷的提取及鉴定.ppt

次黄嘌呤核苷的制备及初步提取,制药11301班第2组 成员：江呈风 陈俊 周丽 许欣 朱赢,一背景介绍,定义 次黄嘌呤核苷（inosine）也称肌苷。是以次黄嘌呤为碱基部分的核糖核苷的一种。次黄嘌呤核苷为白色结晶性粉末或类白色结晶性粉末，无臭；味微苦；在水中略溶，在氯仿、乙醇中不溶，在稀盐酸或氢氧化钠等碱溶液中易溶。肌肉中含量最多，酵母、尿液中也存在。从腺苷与亚硝酸作用或酶解脱氨后得到。紫外线最大吸收248纳米。在核苷磷酸化酶的作用下主成次黄嘌呤。 分子结构,分子式：C10H12N4O5 分子量：268.23,次黄嘌呤核苷,次黄嘌呤核苷的作用,次黄嘌呤核苷的用途十分广泛，是食品和医药产品的重要中间体。在医药工业领域，肌苷可以直接透过细胞膜进入细胞内参与人体代谢，促进体内能量代谢和蛋白质合成，提高丙酮酸氧化酶活力，使低能、缺氧状态细胞的腺三磷水平提高。在医疗上广泛用于治疗心脏病、肝病及由放射线和抗癌药物所引起的白血球减少症、血小板减少症、视神经萎缩、中心性视网膜炎、并能预防和解除由血防药物引起的对心脏或肝脏的副作用；另外还是作为合成利巴韦林、阿昔洛韦等核苷类抗病毒药物的重要中间体；在食品工业领域，次黄嘌呤核苷是作为呈味核苷酸肌苷酸二钠的主要原料，与鸟苷酸二钠混合简称I+G，添加到味精中即是第二代、第三代味精，具有十分广阔的市场。目前，I+G需求量以每年10-20的速度增加。,二.制备工艺,方法介绍,次黄嘌呤核苷的生产方法有化学合成法、菌体自溶法、发酵法。由于化学合成法需要大量有机溶剂，存在原料来源及环境污染等问题在生产中极少使用；菌体自溶法由于其效率太低目前也基本不用；发酵法生产次黄嘌呤核苷由于其产率高、周期短、控制容易等优点，目前已经成为工业化生产次黄嘌呤核苷的重要方法。以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)为发酵菌种制备核苷具有产量高、产物中副产物少、便于产物分离提取等优点，因而，枯草芽孢杆菌成为核苷发酵工业最重要的生产菌。,制备步骤,选用枯草芽孢菌GDIR-1005为保藏菌种； 将葡萄糖磷酸氢二钾硫酸镁苹果酸钠酵母粉琼脂水按10.20.10.22294.5的重量百分比，配制成初级菌种培养基并装入茄瓶； 将步骤中的初级培养基接入保藏菌种，接种量为0.1，在温度370.5条件下静置培养20h2h后获得初级种； 将步骤得到的初级菌种，放入按葡萄糖磷酸氢二钾硫酸镁苹果酸钠酵母粉水30.20.10.21.595重量百分比配制成的摇瓶培养基中，并在往复式摇床上培养，16010转/分，温度370.5，时间周期1012h，当菌种镜检及OD等各项指标达标后即获得摇瓶液体菌种。,将葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、苹果酸钠、酵母粉、水按50.20.10.21.093.5的重量百分比配制成二级菌种培养基，并经121115min1min蒸汽灭菌后泵入二级种子罐，后降温至370.5接入摇瓶菌种，接种量为0.10.02；同时将经过0.250.3Mpa压缩、过滤后的无菌空气输入二级种子罐；此时通风10.20.4v/V.min，pH68，压力0.030.1MPa，培10h12h，经菌种镜检及OD等各项指标达标后即获得二级菌种；,将葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、苹果酸钠、酵母粉、水按150.20.10.10.883.8的重量百分比配制成发酵培养基，经1211、15min1min蒸汽灭菌后泵入发酵罐，后降温370.5接入二级菌种，接种量为100.5；同时在上述步骤中保压、无菌空气输入的条件下，将经1201、8min蒸汽灭菌后5070g/dL的葡萄糖液与0.20.02苹果酸钠同时进行连续流加；此时通风比为10.30.6v/V.min，pH 68，压力0.04MPa0.1MPa，发酵50h60h进行培养；当产苷达到552g/L时，即获得次黄嘌呤核苷发酵液。,三.提取含次黄嘌呤核苷的RNA,1从枯草芽孢杆菌GDIR-1005中提取含次黄嘌呤核苷RNA（Trizol法处理） Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶.Trizol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化DNA及标准化RNA的生产十分有用。 匀浆处理 发酵菌液经离心（3000r/min,5min）后，收集下层物，加入Trizol试液，反复吸打，用匀浆仪处理。,将匀浆液在室温（1530）放置5min ，使核酸蛋白复合物完全分离。 每使用1mlTrizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min . 28,10000r/min离心15min.样品分三层：底层为黄色有机相，上层为无水相，中层为。RNA主要在水相中。 把水相转移到新管中，用异丙醇沉淀水相中的RNA，每使用1mlTrizol加入0.5ml异丙醇，室温放置10min 。 28,10000r/min离心10min.离心前看不见RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。 用75%乙醇洗涤RNA 沉淀，每使用1mlTrizol加入1ml75%乙醇，28不超过7500r/min离心5min，弃上清。,室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾510min,加入25ul200ul无RNase的水或0.5%SDS,用基因枪吸打几次，5560放置10min使RNA溶解。,2.免疫亲和层析法分离纯化含次黄嘌呤核苷 mRNA,2.1原理：采用免疫亲和层析法分离纯化含次黄嘌呤核苷的mRNA(I-mRNA)。将Poly-I与BSA交联，并用Poly-I-BSA交联体免疫家兔，获取抗次黄嘌呤核苷抗血清。将抗次黄嘌呤核苷抗体与蛋白A Sepharose交联，并制备抗体亲和层析柱。将小鼠肺mRNA上样于层析柱，淋洗层析柱后，用洗脱液洗脱I-mRNA。 2.2制备次黄嘌呤核苷抗原与免疫动物 取 0.2g次黄嘌呤核苷酸 加入碘酸钠10ml室温下氧化反应40min,然后加16mol/L乙二醇0.2ml终止反应氧化反应。将 0.5g牛血清白蛋白（BSA）溶于10ml100mmol/l NaHCO3中(PH=9.5)，与氧化后的次黄嘌呤核苷酸混合，室温下水平摇动反应12h 。每10ml反应体积中加入四硼酸150mg ，静置18h ，本步骤使次黄嘌呤核苷酸与BSA 的交联变得牢固和稳定。将次黄嘌呤核苷酸-BSA 交联物在流水中透析8h ，然后再在10倍体积的PBS中透析12h.最终收集透析后所得次黄嘌呤核苷酸-BSA。免疫家兔，收集抗血清检测抗体滴度和特异性。,2.3制备抗次黄嘌呤核苷抗体与蛋白A Sepharose 交联体 将70% 体积的蛋白A Sepharose 与25% 体积的 Tris缓冲 液 ,混匀加入 5%体积的抗次黄嘌呤核苷抗体 ,室温下缓慢摇动 1h，然后装柱。用 10倍体积0.2mol/l 四硼酸钠 离心法洗柱(3000g,5min) 。再将抗次黄嘌呤核苷抗体与蛋白A Sepharose 交联体悬于10倍体积0.2mol/l 四硼酸钠中，然后加入固体 dime.，使之终浓度为 20nmol/l。上述混合物在室温下摇动30min离心弃上清后， 5倍体积氨基乙醇（0.2mol/l,ph=8.0）洗交联体一次 然后将交联体再悬于 氨基乙醇液中室温下缓慢摇动2h, 以终止反应离心后弃上清。将交联体悬于含有0.01% Methiote的PBS 中，置4 保存.,2.4分离纯化I-mRNA 取由小鼠肺组织分离的mRNA50mg,70 加热3min迅速置冰上冷却将变性后 重复上样于抗次黄嘌呤核苷抗体亲和柱3 次柱体积为 2ml。用10 倍体积洗柱缓冲液（1nmol/lATP,1nmol/LCTP,1nmol/LUTP,5nmol/LEDTA的PBS ，PH7.0 ）洗柱，并收集流出液。用洗脱缓冲液（1nmol/lATP,1nmol/LCTP,1nmol/LUTP,5nmol/LEDTA的PBS,PH7.5 ）洗脱结合的 I-mRNA每次200ul，洗脱总体积为 5倍柱体积。乙醇沉淀I-mRNA最后将其溶于10ul 水中。,次黄嘌呤核苷的鉴定,次黄嘌呤核苷的THz光谱 THz波是位于微波和红外之间的电磁辐射，太赫兹时域光谱(terahertz timedomainspectroscopy，简称TI-hTDS)是基于飞秒超快激光技术发展的远红外波段光谱测量新技术利用太赫兹时域(简称THzTDs)技术研究了次黄嘌呤核苷在03一16THz波段的光谱特性结果显示THz渡对该碱基及核苷的结构变化有灵敏响应。,图2,液相色谱检测,将样品制成每1ml中含0.2mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液20l注入液相色谱仪，调节检测灵敏度