泡菜中产细菌素的乳酸菌分离研究.pdfVIP

第 卷第期 西 南 大 学 学 报 （ 自然科学版） 年月 （ ） 文章编号： （ ） 泡菜中产细菌素的乳酸菌分离研究 胡 杨， 项松涛， 杨宇清， 郑一敏， 王琳琳， 胥秀英， 曾品涛， 李 杰 重庆理工大学 药学与生物工程学院，重庆 摘要：实验从泡菜中分离出一株有抑制革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌作用的菌株，经鉴定为乳酸菌中的肠膜 明串珠菌，该抗菌物质对蛋白水解酶敏感，耐热并在较宽的 值范围内保持活性在排除是有机酸和过氧化氢 后，初步认为该菌产生的抗菌物质为抗菌肽，即细菌素 关 键 词：泡菜；乳酸菌；肠膜明串珠菌；细菌素 中图分类号： 文献标志码： 泡菜是以白菜、萝卜、黄瓜、甜椒等新鲜蔬菜为原料，添加食盐、水和调味料，利用蔬菜自身附着的微 生物或添加人工培养的乳酸菌发酵剂，在厌氧环境下进行乳酸发酵而制成的酸性食品泡菜不但味美爽 口，而且具有丰富的营养，含有、 、 、 、 、胡萝卜素、辣椒素、纤维素和蛋白质等多种丰 富的营养成分，在中国很多地区都备受青睐 泡菜生产主要依靠乳酸菌的发酵作用乳酸菌可以产生有机酸、细菌素、过氧化氢、双乙酰等多种天 然抑菌物质具有维持肠道内菌群平衡，提高机体免疫力，促进营养物质吸收等多种功能 尤其是乳酸 菌产生的抑菌活性代谢产物细菌素，不仅可以改善肠道生态，还可以用于食品与饲料的防腐，是目前公认 的一类具有潜在开发价值的天然生物性食品防腐剂 乳酸菌细菌素是指乳酸菌在代谢过程中由核糖体合成的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白质复合物，其 抑菌活性主要针对革兰氏阳性细菌和一些亲缘关系相近的乳酸菌种类，特别是食物的腐败菌和食源的致病 菌，而对革兰氏阴性细菌和真菌则一般无效 对乳酸菌细菌素的研究先前已有许多研究报道，细 菌素作为食品添加剂和抗菌添加剂已得到广泛应用，但对其很多性质了解得还不够深入，在使用细菌素作 为食品防腐剂或添加剂时，还需考虑食品的结构和成分及温度、 值变化等对细菌素活性的影响 国外对乳酸菌细菌素的研究比较早，报道的文献资料也很多，而国内则起步较晚，除了 的研究 外，很少看到有关其它乳酸菌细菌素的报道本文就泡菜中产细菌素的乳酸菌进行了筛选，以了解泡菜中 产细菌素的乳酸菌的情况 材料与方法 实验材料 材料与仪器 胃蛋白酶、过氧化氢酶（ 公司） ；蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、牛肉膏、豆饼粉、乙酸钠、柠檬酸三 收稿日期： 基金项目：国家科技重大专项课题（ ） 作者简介：胡 杨（ ） ，男，湖北恩施人，硕士研究生，主要从事微生物菌株的筛选、培养以及活性成分的分离纯化研究 铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、琼脂粉、氯化钠等均为国产分析纯 隔水式电热恒温培养箱（ 上海跃进医疗器械厂） ； 型手提式不锈钢高压蒸汽消毒器（ 上海三申 医疗器械有限公司） ； 系列水平净化工作台（ 上海浦东物理光学仪器厂） ； 冷冻离心机 ； 电子天平（ 上海精天电子仪器有限公司） 菌株和培养基 乳酸菌（ 肠膜明串珠菌 ） 购于中国工业微生物菌种保藏中心，作为产细菌素的标准对照菌株指示 菌为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，均由本实验室提供 培养基： 培养基：用于培养指示菌 培养基：选择性培养基，用于培养从泡菜中分离出的乳酸 菌自制培养基：用于培养泡菜中分离出的乳酸菌 培养基：酵母膏 ，蛋白胨 ， ，琼脂 ，水 ， 培养基：蛋白胨 ，牛肉膏 ，酵母膏 ，柠檬酸三铵 （） ， 葡萄糖（ ） ，乙酸钠（ ） ，磷酸二氢钾（ ） ，硫酸镁（ ） ，硫酸锰（ ） ，琼脂 ，水 ， 自制培养基：豆饼粉 ，葡萄糖（ ） ，干酵母 ，乙酸钠（ ） ，柠檬酸三铵 （） ，磷酸氢二钾（ ） ，硫酸镁（ ） ，硫酸锰（ ） ，琼脂 ，水 ， 方 法 产抑菌物质的乳酸菌的分离与鉴定 取自然发酵泡菜汁液，稀释（ 、 、 、 、 ） 个数量级作为培养液，倒 平板，待 凝固后，蘸取培养液在培养基上用涂布器涂匀，静置片刻，然后置 恒温培养箱中培养 直至长出 明显的单菌落，挑选单菌落穿刺接种于 培养基平板（ 含有指示菌：金黄色葡萄球菌和大肠杆菌） 中，放 置于 恒温培养箱中培养 ，检查平板上形成的抑菌圈 挑选形成抑菌圈的菌株做革兰氏染色，观察菌体形态和染色特征，进行过氧化氢酶试验、耐热试验 厌氧或兼性厌氧的无芽胞菌，过氧化氢酶阴性，初步认定为乳酸菌然后做生物学特性试验以确定为何 种乳酸菌，包括糖发酵试验、吲哚、硝酸盐还原、明胶液化、耐盐性试验、耐酸性试验等 乳酸菌上清液的制备 将从泡菜中筛选出的纯化好的单菌落乳酸菌接种于斜面 培养基中，放置于 恒温培养箱中培 养 ，然后将培养好的光滑饱满的菌落接种于自制液体培养基（ 瓶） 中，再放置于 恒温培养箱中静置培养 后， 离心 ，收集上清液，保存于冰箱中备用 细菌素抑菌活性的检测 参照文献采用打孔法测定乳酸菌细菌素对细菌的抑制作用 ，本实验与参照文献不同之处是将打孔改 为用无菌海棉圈吸取发酵上清液作抑菌试验步骤如下：将供试菌（ 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌） 活化后， 用倾注法制作供试菌平板：在平板中先滴入适量灭菌蒸馏水，挑出几环供试菌在水中涂匀，最后将熔化的 培养基倾倒入平板中（ 注意： 培养基温度不易太高，应在 之间） ，待其凝固后，用无菌镊 子夹住吸取发酵上清液至饱和的海棉圈（ 直径 ，高的圆柱形） ，轻轻放在平板上，最后将平板 放置于 恒温培养箱中培养 ，观察抑菌效果，同时测定抑菌圈直径 不同 值对细菌素抑菌效果的影响 用盐酸、氢氧化钠调发酵上清液 值分别为、，以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为指示 菌，用海棉圈吸取发酵液的方法（ 即琼脂扩散法） 观察不同 值下细菌素的抑菌效果 不同温度对细菌素抑菌效果的影响 第期 胡 杨，等：泡菜中产细菌素的乳酸菌分离研究 为了测定温度对细菌素抑菌活性的影响，将发酵上清液分别置 、 水浴中处理 ，检测 对热的耐受力 抑菌物质对胃蛋白酶的敏感性试验 为了测定酶对发酵上清液的抑菌活性的影响，用发酵液配制胃蛋白酶的浓度为 ，以加入胃蛋 白酶（ ） 的无菌水为对照，分别调 值至胃蛋白酶的最适值（ ）在胃蛋白酶的最适温 度（ ） 下，处理，然后用稀盐酸调节经酶处理的上清液 至中性，用琼脂扩散法测定酶对抑菌物质 的影响 结果与讨论 产抑菌物质的乳酸菌的分离与鉴定 对具有抑菌圈的菌株进一步做形态学和生化实验，发现有株符合肠膜明串珠菌的特性其形态学特 征为：菌落形态：平板上为圆形菌落，菌落光滑、粘稠、呈乳白色，直径约 ，灰白色，凸起细 胞形态：挑起单菌落，涂片，革兰氏染色镜检，结果为革兰氏染色阳性，成对或成链状的球菌细菌的生理 生化特性鉴定见表 表 肠膜明串珠菌的鉴定 触媒明胶液化石蕊牛奶果糖半乳糖乳糖麦芽糖木糖蔗糖 注：“” 为阳性反应；“” 为阴性反应 细菌素的抑菌活性 用琼脂扩散法测定细菌素对革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌的抗菌活性（ 表） 表 细菌素的抑菌活性 发 酵 液 抑菌圈直径（ 海棉圈大小 ） 大肠杆菌（ 平均值）金黄色葡萄球菌（ 平均值） 发酵液（ ） 注：平均值为次实验的平均值 结果表明：细菌素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌作用，但对革兰氏阳性菌（ 金黄色葡萄球菌） 的抑菌作用优于革兰氏阴性细菌（ 大肠杆菌） 值对细菌素抑菌活性的影响（ 表） 表 值对细菌素抑菌活性的影响 值 抑菌圈直径（ 海棉圈大小 ） 大肠杆菌（ 平均值）金黄色葡萄球菌（ 平均值） 原液 注：平均值为次实验的平均值 细菌素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌作用，从表可以看出，不同 值下细菌素对不同供 试菌的抑菌活性不同， 为原液时，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑制作用且较明显； 值为、 、 时，对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑制作用依次下降 温度对细菌素抑菌效果的影响（ 表 ） 以未经过温度处理的原液作为对照，结果如下 西南大学学报（ 自然科学版） ： 第 卷 表 温度对抑菌活性的影响 温 度 抑菌圈直径（ 海棉圈大小 ） 大肠杆菌（ 平均值）金黄色葡萄球菌（ 平均值） 对照组 注：平均值为次实验的平均值 结果表明：温度对细菌素抑菌活性的影响很小 细菌素对胃蛋白酶的敏感性试验（ 表 ） 表 胃蛋白酶对细菌素抑菌活性的影响 酶敏感性 抑菌圈直径（ 海棉圈大小 ） 大肠杆菌金黄色葡萄球菌 对照组 胃蛋白酶 注：“” 为无抑菌圈 从表可以看出：该细菌素对胃蛋白酶比较敏感 讨 论 一些乳酸菌产生的细菌素有作为食品防腐剂的潜力，安全、无副作用的细菌素在食品中的应用是解决 食品腐败和食源性疾病问题的有利武器之一我国有大量由乳酸菌发酵制造的传统食品，因而有大量的乳 酸菌资源，为了最有效的利用它们，有许多工作要做，其中之一就是从这些乳酸菌中分离鉴定出哪些是产 细菌素的菌株，为以后应用此细菌素做好铺垫 乳酸菌在代谢过程中通过产生有机酸、过氧化氢和细菌素等抗菌物质而对许多微生物有抑制作用文 中通过调节乳酸菌发酵上清液的 值来排除有机酸的影响，用过氧化氢酶处理来排除过氧化氢的干扰， 证实在乳酸菌的发酵上清液中的抗菌物质为蛋白类细菌素成分在排除酸性影响之后，细菌素的抑菌活性 随着酸度的降低而减弱 在 值为（ 原液） 、时，发酵上清液对大肠杆菌的抑菌活性优于对金黄色葡 萄球菌的抑菌活性，而在 值为 、时抑菌活性都有所减弱，可能是弱酸性条件影响了细菌素的抑菌 活性，对不同的细菌表现不同的作用 用胃蛋白酶处理使抗菌物质灭活表明其本质是蛋白质， 、煮沸处理 后不能使其失活，表明 该物质有耐热的特性 细菌素的抗菌谱通常较窄 ，但本实验研究分离出来的乳酸菌细菌素具有较广的抑菌谱，而且抑菌 活性都比较强，因而具有潜力巨大的应用前景目前本实验正在研究该细菌素对真菌的抑菌活性 ，为天 然食品防腐剂的开发提供实验依据 参考文献： 巨晓英，韩 烨，周志江自然发酵泡菜中乳酸菌的分离鉴定 ， （ ） ： ， ， ： 田召芳，牛钟相，常维山，等乳酸菌细菌素的研究进展 微生物学杂志， ， （） ： ， ， ， ， ： 荆 谷，孔 健，李德冠，等乳酸乳球菌 所产类细菌素 的初步研究 食品与发酵工业， ， （） ： 第期 胡 杨，等：泡菜中产细菌素的乳酸菌分离研究 田召芳，常维山，唐珂心，等产细菌素乳酸菌的筛选及体外抑菌试验 中国微生态学杂志， ， （） ： 何 宁，王昌禄，顾晓波，等杯碟法检测乳酸菌素活性优化条件的研究 天津轻工业