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灵芝活性多糖的提取工艺研究 陈洁2,雷林生1,常花蕾1 (1. 南方医科大学药学院 药物研究所, 广东 广州 510515; 2. 广州市红十字会医院 药剂科,广东 广州 510220) 摘要:目的 确立水提醇沉法与超声提取法相结合提取灵芝活性多糖的最佳工艺。 方法 以脾细胞代谢 MTT 活力为评价指标,采用正交试验对超声时间、水提温度和水提时间等因素进行考察,寻求最佳的提 取工艺。 结果 各因素对灵芝多糖脾细胞代谢 MTT 活力的影响大小排列为: 超声时间水提温度水提 时间,超声时间对灵芝多糖活性影响显著。 提取最佳工艺为:超声提取时间 20 min,水提取温度 80 益, 水提取时间 2 h。 结论 本工艺为提取活性灵芝多糖提供了一定的参考。 关键词:灵芝多糖;脾细胞;提取工艺;正交试验 中图分类号:R284摇 文献标识码:A摇 文章编号:1006-8783(2009)04-0348-04 Study on extraction of active polysaccharides from Ganoderma lucidum CHEN Jie2,LEI Lin鄄sheng1,CHANG Hua鄄lei1 (1. Institute of Pharmaceutical Sciences,School of Pharmaceutical Sciences,Southern Medical University, Guangzhou,Guangdong 510515,China; 2. Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou,Guangdong 510220, China) Abstract:Objective To explore an optimum extraction procedure(water extraction alcohol precipitation and ultrasonic extraction method) of active polysaccharides from Ganoderma lucidum. Methods By using colorimetric methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay of splenic cells of mice as evaluation indicator, orthogonal test was conducted to evaluate ultrasonic extraction time,water extraction temperature,and water extraction time to explore the optimal extraction procedure. Results The main influencing factors of colorimetric methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay of splenic cells of mice were ultrasonic extraction time,water extraction temperature,and water extraction time in turn. The optimal conditions of orthogonal experiment:ultrasonic extraction for 20 minutes,water extraction at 80 益 for 2 hours. Ultrasonic extraction time had significant effect on extraction of active polysaccharides from Ganoderma lucidum. Conclusion The technology provided references for extraction of active polysaccharides from Ganoderma lucidum. Key words: Ganodermalucidumpolysaccharides; spleniccells; extractionprocedure; orthogonal experiments 收稿日期:2009-04-14;修回日期:2009-06-15 作者简介:陈洁(1975-),女,主管药师,从事医院制剂检验工 作,电话:020鄄34403083,020鄄35946659,Email:Iama _cat163. com;通讯作者:雷林生,教授,博士生导 师,从事免疫药理研究,电话:020鄄61648167。 摇 摇 灵芝是我国传统的补益中药,现代研究表明灵 芝多糖是其主要活性成分之一,灵芝多糖具有抗肿 瘤及免疫调节作用1,2。 灵芝多糖提取方法有传统 的水提醇沉法3,4、超声波法4-6、酶法,还有冷冻预 处理法、超声波催化纤维素酶法、超临界萃取法等。 灵芝多糖的活性在不同的提取工艺中变化很大,提 取率高并不意味其有效活性高。 现有文献对灵芝多 糖提取工艺的研究未与其活性联系起来。 本文拟采 用水提醇沉法和超声波法相结合提取灵芝活性多 糖,应用正交试验法设计试验,探讨提取工艺中影响 因素对多糖活性的影响,采用小鼠脾细胞增殖实验 检测多糖的免疫活性,确立优化的提取工艺。 843 广东药学院学报摇 Journal of Guangdong Pharmaceutical College摇 Aug. 2009,25(4)摇 1摇 实验材料 1. 1摇 动物 SPF 级近交系 BALB/ c 小鼠,雌雄兼用,8 10 周龄,体质量(20依2)g,由南方医科大学实验动物中 心提供,证号:SCXK(粤)2006鄄0015。 1. 2摇 材料 灵芝(产地:广西,批号:20080101,广州市药材 公司中药饮片厂)。 1. 3摇 仪器 LIBROR AEG鄄220G 型电子天平 ( SHIMADZU Corporation);超声仪(广州华南超声设备厂);恒温 水浴器(汕头市医用设备厂有限公司);RE鄄52A 型 旋转蒸发仪(上海雅荣生化设备仪器有限公司); D1鄄2SA 型鼓风干燥箱(上海浦东荣丰科学仪器有限 公 司 ); DOA鄄P133A鄄B8 型 抽 滤 减 压 泵 ( Gast Manufacturing,Inc. );ST鄄21 型高速冷冻离心机(美 国杜邦公司);Universal 16A 型低速离心机(Hettich 公司);Benchmark PlusTM型连续波长酶标仪(Bio鄄 RAD 公司);5410 型 CO2培养箱(Thermo 公司)。 1. 4摇 试剂 95%乙醇(广东广宁县葡萄糖药业有限公司, 批号:20071101);葡萄糖、硫酸等试剂均为分析纯; 重蒸苯酚(南方医科大学化学教研室);RPMI 1640 培养基(GIBCO 公司产品);噻唑兰(MTT)、Con A (刀豆蛋白 A)均为 Sigma 公司产品。 2摇 方法 2. 1摇 正交试验设计 根据文献报道,超声提取时间(因素 A)、水提 取温度(因素 B)、水提取时间(因素 C)对灵芝多糖 的提取影响较大,最佳的提取条件在一定范围之内, 超声时间为20 40 min,提取时间为1. 5 3 h,提取 温度为 80 100 益 6-8。 根据预实验及文献,本文 正交试验对上述三因素,每个因素设三水平进行考 察,以脾细胞代谢 MTT 活力作为考察指标。 根据正 交试验的综合评分选择最佳方案。 正交设计选用 L9(34)正交表,见表 1。 2. 2摇 提取方法 精密称取灵芝粉 50 g 置圆底烧瓶中,加入 10 倍量乙醇, 70 益水浴回流 30 min 作预处理,过滤, 滤渣置圆底烧瓶中,加入 15 倍量水后按照正交水平 表进行试验,先进行超声(因素 A)处理,超声完成 后,放入恒温水浴器内,按照提取温度(因素 B)和 时间(因素 C)条件的三水平平行操作,水提完成后 过滤,滤液于 2 10 益冷藏放置过夜,抽滤,滤液减 压浓缩至约100 mL,加入3 倍量乙醇,2 10 益冷藏 放置过夜,抽滤,沉淀用100 mL 热水溶解,水浴蒸至 稍干后 60 益恒温干燥,得水溶性粗多糖,精密称量 后计算多糖提取率和含量。 表 1摇 正交试验的因素水平表 Table 1摇 Table of L9(34) orthogonal design 水平 因素 A t(超声) / min B 兹(水提) / 益 C t(水提) / h 120801 230902 3401003 2. 3摇 多糖的测定 灵芝多糖的测定采用苯酚鄄硫酸比色法,以葡萄 糖为标准品。 2. 4摇 脾细胞代谢 MTT 活力测定 取健康 BALB/ c 小鼠,脱颈椎处死,无菌取出脾 脏,常规制备脾细胞悬液,用含 10% 新生牛血清 RPMI 1640 培养液(以下简称全培)调整细胞浓度为 8伊106个/ mL ,在已加好待测样品或者对照试剂的 96 孔板中每孔加入上述细胞悬液 100 滋L。 使总体 积为 200 滋L,置培养箱中在饱和湿度、5%CO2、37 益 条件下培养 48 h。 小鼠脾细胞培养结束前 4 h,每孔加入 0. 25% MTT(生理盐水配制)20 滋L,继续培养4 h,然后每孔 加二甲基亚砜 100 滋L,振摇 2 min 使 MT忆T 的紫色 还原产物完全溶解。 最后用酶标仪在 570 nm 处测 定光密度,结果用 570 nm 处的吸光度值(A)表示。 2. 5摇 统计分析 采用 SPSS 13. 0 统计软件中的正交设计方差分 析法对数据进行统计分析。 3摇 结 果 正交试验结果见表 2 3。 从表 2 中脾细胞代 谢 MTT 活力极差(R)可知,影响因素主次顺序为 A BC,各因素的最佳水平分别为 A 颐123,B 颐12 3,C 颐213;从表 3 方差分析结果可见,除 A 因素 对脾细胞代谢 MTT 活力有显著性影响外,其他因素 均无显著性影响。 综合以上结果,确定最佳提取工 艺为 A1B1C2,即超声提取时间 20 min,水提取温度 80 益,水提取时间 2 h。 943摇 第 4 期摇陈洁,等. 灵芝活性多糖的提取工艺研究 表 2摇 正交试验结果 Table 2摇 The results of the orthogonal experiment 试验号ABC提取率/ %多糖含量/ % 脾细胞代谢 MTT 活力(軃x依s) 11110. 19034. 60. 383 5依0. 021 0 22220. 27257. 80. 294 0依0. 023 3 33330. 26462. 40. 239 2依0. 020 2 41320. 35950. 90. 328 0依0. 034 7 52130. 20341. 90. 304 1依0. 027 8 63210. 17343. 40. 259 2依0. 018 1 71230. 32149. 90. 315 2依0. 014 9 82310. 24538. 10. 265 3依0. 017 7 93120. 24846. 00. 297 5依0. 018 0 提取率K10. 8700. 6410. 詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪 608 K20. 7200. 7660. 879 K30. 6850. 8680. 788 R0. 0620. 0750. 090 多糖含量K1135. 4122. 5116. 詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪 1 K2137. 8151. 1154. 7 K3151. 8151. 4154. 2 R5. 59. 712. 9 脾细胞代谢 MTT 活力 K11. 026 70. 985 10. 詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪詪 908 0 K20. 863 40. 868 40. 919 5 K30. 795 90. 832 50. 858 5 R0. 0770. 0510. 020 表 3摇 方差分析(依据多糖脾细胞代谢 MTT 活力) Table 3摇 ANOVA analysis (according to colorimetric methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay of splenic cells of mice) 方差来源自由度SSMSF 值P 值 A20. 009 390. 004 6936. 420. 05 B20. 004 240. 002 1216. 46 C20. 000 700. 000 352. 71 误差20. 000 260. 000 13 摇 F0. 05(2,2)= 19. 0 4摇 讨 论 4. 1摇 本文采用水提醇沉法鄄超声提取法作为灵芝活 性多糖的提取工艺,两种方法结合显著减少水提时 间和次数,减少对多糖活性的破坏,多糖含量比文献 报道3,4,6,9的结果有显著提高。 4. 2摇 超声20 min 的脾细胞代谢 MTT 活力比30 min 和 40 min 的高。 原因是超声波具有较强的机械剪 切作用,长时间作用使多糖结构破坏,导致多糖活性 下降。 另外,超声时间过长,细胞进一步破碎,杂质 溶出去杂质时造成多糖损失,这也是多糖提取率有 所下降的原因之一。 4. 3摇 水提时间 2 h 的脾细胞代谢 MTT 活力比 1 h 和3 h 的高;水提温度80 益的脾细胞代谢 MTT 活力 比 90 益和100 益的高。 原因是提取时间增加,促进 细胞的多糖物质向外扩散,但随着时间和温度进一 步增加,细胞破碎程度过大,长时间热水提取,多糖 分子容易受热分解,使多糖活性有所下降。 4. 4摇 有文献报道有关灵芝多糖有水不溶性多糖、水 溶性多糖、酸性多糖、碱性多糖等10,11。 本文的提 053广东药学院学报摇第 25 卷 摇 取工艺可能使一部分多糖,如水不溶性多糖,在乙醇 的预处理和热水提取后加入乙醇沉淀的过程中被弃 去,得到的主要是水溶性多糖,因此这可能是本文实 验中的灵芝多糖提取率比文献报道8,10要低的原因 之一。 参考文献: 1 戴则林,董昌武. 灵芝多糖的生物活性研究进展J. 安 徽中医学院学报,2005,24(5):60-62. 2 宁安红,曹婧,黄敏等. 灵芝多糖对荷瘤小鼠肿瘤免疫系 统的影响J. 中国微生态学杂志,2004,16(1):16-17. 3 李艳,赵海燕,率建宁. 灵芝多糖提取工艺研究J. 中成 药,2006,28 (7):1052-1054. 4 胡斌杰,陈金锋,王宫南. 超声波法与传统热水法提取灵 芝多糖的比较研究J. 食品工业科技,2007,28(2):190 -192. 5 郭孝武. 超声技术在中草药成分提取中的应用J. 中草 药,1993,24(10):548. 6 徐凌川,张华,许昌盛,等. 超声波提取灵芝多糖的最佳 工艺探讨J. 中国中药杂志,2005,30(6):471-472. 7 刘英梅,李春华,陈鸿雁. 灵芝孢子粉中多糖提取工艺的 研究J. 中成药,2006,28(3):332-335. 8 罗立新,姚汝华,周少奇. 灵芝多糖的分离与纯化J. 食 品工业科技,1998,3(3):4-7. 9 胡斌杰,韩艳霞,姬红. 正交试验法超声提取灵芝多糖的 最佳工艺研究J. 中药材,2008,31(1):142-143. 10 鉏晓艳,张日俊,张功,等. 灵芝多糖的结构及功能研究 J. 饲料研究,2004,12:37-39. 11 张卫国,刘欣,陈永泉. 灵芝多糖的研究进展J. 饮料 工业,2003,6(4): 詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬 5-10. 阳离子泵抑制剂类药物可引起健康成人酸相关症状 根据发表在美国胃肠病协会正式刊物胃肠病学上的一项新研究结果显示,健康成人使用阳离子泵抑制剂 类药物(PPIs)8 周后停药,可出现诸如胃灼热、反酸、消化不良等酸相关症状。 负责该项研究的丹麦哥本哈根大学 Christina Reimer 医学博士指出:“观察到 40% 的志愿者,之前从未有过胃 灼热、反酸、消化不良等酸相关症状,在使用数周 PPIs 后停药发生上述酸相关症状,这项发现有潜在重要的临床和 经济学意义。 该研究显示,停止使用 PPIs 可导致尚未被识别的影响,涉及在特定患者群中需要进行调查的有临床 意义的酸反弹现象。冶 PPIs 治疗酸相关症状得到广泛使用并正快速攀升。 新使用 PPIs 治疗的患者发病率保持稳定,但长期治疗的 发病率反而增加,对其