级蛋白质的生物合成.ppt

第十一章 蛋白质的生物合成,DNA,DNA,RNA,蛋白质,复制,转录,翻译,逆转录,基因遗传,基因表达,生物中心法则,忠实复制,忠实转录,忠实翻译,第一节 遗传密码,一、遗传密码和密码单位 1. 遗传密码 ( genetic code ) 指mRNA中的核苷酸序列与多肽中氨基酸序 列之间的对应关系, 通常是指核苷酸三联体决定 氨基酸的对应关系, 故也称三联体密码或密码子. 2. 密码单位 1954年物理学家Gamov G 首先对遗传密码进 行探讨: 41=4; 42=16; 43=64, 足以编码20种氨基酸, 密码子 (codon) 应是三联体（triplet）.,密码子或称三联体密码，即mRNA上决定一 个特定氨基酸的三个核苷酸 。 3. 密码子的确定 用各种人工合成模板在体外翻译蛋白质的方 法确定 用核糖体结合技术测定密码子中的核苷酸排 列顺序 1961 1965年 4 年时间，完全确定了编码20 种天然氨基酸的密码子，编出了遗传密码字典。,12,二、遗传密码的基本特征 1. 遗传密码的连续性(commaless) 密码子之间没有任何起“标点”作用的空格,阅 读mRNA 时是连续的,一次阅读3个核苷酸(碱基),2. 遗传密码的不重叠性(nonoverlapping) 在绝大多数生物中,阅读mRNA时是以密码子为单位，不重叠地阅读。 少数大肠杆菌噬菌体的RNA基因组中部分基因的遗传密码是重叠的。,不重叠密码 重叠密码,3.遗传密码具有简并性（degeneracy） (1)除Met(AUG)和Trp(UGG)外,每个氨基酸 都有两个或更多的密码子,这种现象称为密码子 的简并性（degenecy）。 (2)同义密码：同一个氨基酸的不同密码子称 同义密码子（synonyms）。 (3)简并性的生物学意义: 减少有害突变, 对生物物种的稳定有一定意义 (4)密码的简并性往往表现在密码子的第三位 碱基上。,4. 密码的变偶性摆动性(wobble) tRNA上的反密码子与mRNA上的密码子配对 时, 密码子的第一位、第二位碱基配对是严格的, 第三位碱基可以有一定变动, Crick称这种现象为 密码的摆动性或变偶性( wobble )。如tRNA反密码 子第一位的IA、U、C配对。 （在密码子3端的碱基和反密码子5端的互补碱基之间 形成的相对松散的碱基配对摇摆现象。） 显然, 密码子的专一性基本取决于前两位碱基, 第三位碱基起的作用有限(有较大灵活性)。 所以几乎所有氨基酸的密码子都可以用 和 来表示。,切记： 在书写或阅读密码子、反密码子的碱基顺序时，一定都按5 3方向阅读！,tRNA 反密码子中除A、U、 G、 C 四种碱基外, 还经常在第一位出现次黄嘌呤( I )。 I 可以与A、 U 、C 三者之间形成碱基对, 使带有次黄嘌呤的反密码子可以识别更多的简并密码子。 由于变偶性的存在, 细胞内只需要32种tRNA, 就能识别61个编码氨基酸的密码子。 原核和真核细胞都只合成约30种带有反密码子的tRNA。,5.遗传密码的通用性和变异性 (1)通用性:指各种低等和高等生物,包括病 毒、细菌及真核生物,基本上共用一套遗传密码. (2)密码的变异性:目前已知线粒体DNA(mtDNA) 的编码方式与通用遗传密码子有所不同.,6.密码子有起始密码子和终止密码子 (1) 起始密码子: AUG(Met) 多数原核,真核生物 GUG 少数情况 (2) 终止密码子: UAA、UAG、UGA 不编码任何氨基酸, 又称为无义密码子 (nonsense codons)或终止密码子(chain- terminating codons), 它们单个或串联在一起用于 多肽链翻译的结束，没有相应的tRNA存在。,许多原核生物在mRNA的起始密码子上游约10个核苷酸处(-10区), 通常有一段富含嘌呤核苷酸的序列, 与16S rRNA的3端部分互补, 有助于mRNA与核糖体小亚基的结合。该序列最初是由Shine-Dalgarno 发现的, 故称之为SD序列(Shine-Dalgarno sequence)。,关于SD序列,第二节 核糖体,一、核糖体是蛋白质合成的工厂 用放射性同位素标记氨基酸，注射到小鼠体 内，经短时间后取出肝脏，制成匀浆，离心，分 离各细胞器，发现核糖体放射性最强，说明核糖 体是蛋白质合成部位。,二、核糖体的结构,原核生物,真核生物,三、核糖体的活性位点,四、核糖体的功能,参与多肽链的启动、延长、终止，并“移动”含有遗传信息的模板mRNA,Up-to-date Viewpoint: “核糖体是1种核酶, 它催化肽键的形成, 将蛋白质生物合成牢牢地控制在RNA的手中。”,第三节 转移RNA的功能,在蛋白质合成中，tRNA起着运载氨基酸的作用，按照mRNA链上的密码子所决定的氨基酸顺序将氨基酸转运到核糖体的特定部位。 tRNA有两个关键部位： 3端CCA: 接受氨基酸, 形成氨酰-tRNA.需ATP提供活化氨基酸所需的能量。 与mRNA结合部位反密码子部位(tRNA的接头作用) 此外, tRNA上尚有 (3)识别氨酰tRNA合成酶的位点, (4)核糖体识别位点,第四节 蛋白质生物合成的分子机制,一、肽链延伸合成的方向和速度 1. 方向 N 端 C 端 2. 速度 肽链延伸的速度极快，一个核糖体合成一条完整的血红蛋白-链(146个AA)需3分钟, 平均0.8AA/秒；大肠杆菌 20个AA/秒。,二、mRNA 上翻译的方向 1. 用人工合成的多核苷酸作模板证明：,2. 翻译方向： 53,三、原核生物蛋白质生物合成的分子机制,氨基酸在掺入肽链前必须被激活，这在胞液中进行。 氨基酸的激活是指各种参加蛋白质合成的AA与携带它的相应的tRNA结合成氨酰-tRNA的过程。激活反应在氨酰-tRNA 合成酶的催化下进行。,(一) 氨基酸的激活,氨基酸的激活 1. 部位: 细胞质 2. 酶: 氨酰-tRNA合成酶 3. 能量: 消耗2ATP 4. 产物: 氨酰-tRNA 甲酰化产物 f Met-tRNA(原核生物起始AA) 5. 激活过程: 1) 氨基酸-AMP-酶复合物的形成 2) 氨基酸从氨基酸-AMP-酶复合物转移到相应的tRNA上,AA + ATP + E AA-AMP-E + PPi,Mg 2+ Mn 2+,AA-AMP-E + tRNA 氨酰-tRNA + AMP + E,氨基酸激活的总反应式是：,氨酰-tRNA合成酶,氨基酸 + ATP + tRNA + H2O 氨酰-tRNA + AMP + PPi,20种氨基酸中, 每一种氨基酸都有各自特异 的氨酰-tRNA合成酶。,氨酰-tRNA合成酶具有高度的专一性: 它既 能识别相应的氨基酸（L-构型），又能识别与此 氨基酸相对应的一个或多个tRNA 分子； 氨酰-tRNA合成酶具有校对功能：即使AA识 别出现错误，此酶具有水解功能，可以水解非正 确组合的氨基酸和tRNA之间形成的共价联系。 这种高度专一性和校对作用, 保证了氨基酸 与特定的tRNA准确匹配, 从而使蛋白质的合成具 有一定的保真性 (翻译过程的错误频率10-4)。 (氨酰-tRNA合成酶与tRNA的相互作用被称为“第二遗传密码”),(二) 肽链合成的起始 1. 70S起始复合物的形成 (1) 起始氨基酸及起始tRNAi,起始氨酰-tRNAi: 甲硫氨酰-tRNAi 甲酰化：,起始氨基酸,原核：甲酰甲硫氨酸 f Met,真核：甲硫氨酸 Met,甲酰化后才能与IF2 结合生成30S复合物 甲酰化防止起始氨基酸进入延伸中的肽链 使f Met-tRNAi 结合在核糖体P部位 延长因子EF-Tu识别未甲酰化的 Met-tRNA,原核：甲酰甲硫氨酸 ( fMet ),翻译起始需要有一 个接载fMet (原核生物) 或Met (真核生物)的起 始tRNA (tRNAi)。 但因tRNAi的TC 环没有与核糖体的A位 处5S rRNA的一序列互 补的保守序列，所以起 始用的tRNAi只能进入 核糖体的P位。,细菌中的起始因子: IF1: 结合在30S亚基上作为完全起始复合物 的一部分，起稳定此复合物的作用。 IF2: 结合到特异的起始tRNA(fMet-tRNAi ), 并将起始tRNA置于小亚基上。 IF3: 30S小亚基特异地与mRNA起始部位结 合需要IF3。IF3还作为70S核糖体的解离因素，产 生30S亚基。,(2) 70S起始复合物的形成,(三) 肽链的延长,肽链的延长分为4个步骤： 进位 转肽 脱落 移位-核糖体循环 1. 进位： 1) 一个新的氨酰-tRNA进入A位 2) 延长因子参加 3) 消耗1个GTP,原核生物蛋白质合成的延伸因子,2. 转肽： 1) 肽酰基从P位转到A位, 肽键的形成。 2) 负责肽键合成的酶称为肽酰转移酶 (peptityl transferase)，简称转肽酶。 3) 肽的转移是核糖体大亚基 (50S或60S) 的功 能。 4) 抗菌素嘌呤霉素抑制蛋白质合成, 使新生的 肽链在合成未完成之前就释放出来。,3. 脱落 转肽后，P部位上空载的tRNA经出口位点 (E) 脱落,4. 移位： 1) 核糖体向mRNA 3端移动一个密码子，移 位导致肽酰-tRNA从A位点移出，进入P位点; 空着的A位点为下一个密码子对应的氨酰-tRNA 的进入作好准备。 2) 需要1个GTP,3) 三位点模型: 1989年德国的Nierhaus 等提 出模型认为，细菌tRNA及mRNA相对于核糖体 发生移位后，空载tRNA并未立即从核糖体上解 离下来，而是移到了E位点（出口位点），当新 的氨酰-tRNA结合到A位点时，E位点的空载 tRNA才解离下来，此过程涉及到核糖体构象的 变化, 该变化有利于核糖体对正确氨酰-tRNA 的 识别作用，从而提供了蛋白质合成的精确性。,(四) 肽链合成的终止与释放 1. 终止信号 1) 终止密码子: UAA、 UGA 、UAG 正常细胞不含能和终止密码子互补的反密 码子的tRNA，这些终止密码子能被终止因子所 识别。 2) 释放因子（release factor，RFs）： RF1 : 识别UAA 、 UAG RF2 : 识别UAA 、 UGA RF3 : 不识别终止密码子, 但刺激另外两个 因子的活性，协助肽链释放,2. 终止机制: 1) 释放因子与终止密码子结合使转肽酶活性 变成水解酶活性，水解了P位点上多肽与tRNA 之间的键，释放出多肽和tRNA。 2) 在基因中，终止密码子总是紧接在编码最后 一个氨基酸的密码子后面。任何一个三联密码发 生无义突变时都足以终止其基因的蛋白质合成。 3) 在原核生物的基因中，UAA是最常见的终止 密码，其它依次为UGA和UAG，但阅读UGA存 在更多的错误。（错误阅读终止密码就是一个氨 酰-tRNA对它产生错误反应，使蛋白质合成继续 进行，直到另一个终止密码出现）。,多核糖体 是一个mRNA分 子与一定数目的单个 核糖体结合而成的， 形成念珠状 。每个 核糖体可以独立完成 一条肽链的合成，提 高了翻译的效率。,原核生物 转录与翻译相偶联,前体蛋白是没有活性的，常常要进行一系列翻译后加工，才能成为有功能的成熟蛋白。蛋白质合成后的加工主要有以下几种方式。 1. 氨基端和羧基端的修饰：在原核生物中几乎所有蛋白质都是从N-甲酰蛋氨酸开始，真核生物从蛋氨酸开始。甲酰基经酶水解而除去，蛋氨酸或者氨基端的一些氨基酸残基常由氨肽酶催化而水解除去。因此，成熟的蛋白质分子的N-端没有甲酰基，或没有蛋氨酸。同时, 某些蛋白质分子氨基端要进行乙酰化,在羧基端也要进行修饰,(五) 肽链的折叠和加工处理,2. 除去信号肽：某些蛋白质氨基端有一段 1530个氨基酸残基的顺序，这段顺序称作信号 肽，与蛋白质传送到特定的细胞器、膜，或分泌 出细胞外有关。信号肽在运送过程中通常由专一 的酶催化而水解除去。 3. 羟基氨基酸的磷酸化：某些蛋白质分子中 的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的羟基，在酶催 化下被ATP磷酸化。磷酸化在酶的活性调节中有 重要意义。 4. 羧化反应：某些蛋白质, 如凝血酶等凝血因 子, 含有多个-羧基Glu, 这一羧基是在需Vit K 的酶催化下进行的。,5. 羟基化反应: 胶原蛋白中的脯氨酸与赖氨 酸的羟基化，由相应的羟基化酶催化完成。 6. 甲基化反应：某些蛋白质中的赖氨酸残基 需要甲基化，某些谷氨酸残基的羧基也要甲基 化，以除去负电荷。 7. 加糖链：糖蛋白的糖链是蛋白质合成之后, 在通过高尔基体时，经过糖化而形成的。糖链或 加在天冬氨酸残基上，或加在丝氨酸、苏氨酸残 基上。,8. 加辅基：蛋白质与辅基的结合也是在翻译 之后进行的，如乙酰CoA羧化酶的辅基生物素 和细胞色素C的血红素。 9. 二硫键的形成：真核细胞合成的某些蛋白 质，往往能自发地折叠形成其天然构像，分子内 的半胱氨酸的巯基之间形成共价键二硫键。二 硫键在稳定蛋白质空间构型中起着重要作用。例 如胰岛素分子的成熟是借核糖体上释放的前胰岛 素原经自发折叠、形成二硫键，然后再切除C肽 而形成的。,10. 蛋白质前体的裂解：一种蛋白质前体能产 生多种多肽激素，如垂体产生的几种小肽激素是 来源于同一个大的蛋白质前体。 11. 新生肽链折叠成有活性的构象：需要分子 伴侣(molecular chaperones)辅助。 12. 蛋白质自我剪接：1990年，Hirata等首次 报道一种新的蛋白质加工方式蛋白质自我剪 接。他们发现，酿酒酵母细胞基因TFP1表达生 成两种蛋白，较大的（69103）是液泡H ATPase的催化亚基，它来自TFP1基因5编码区 和3编码区，较小的（50103）是由该基因中 央区编码的。他们证明，这两种蛋白是同一条多,肽链经过自我剪接产生的，较小的蛋白是被切割 下来的部分，较大的蛋白在切除较小蛋白后再连 接而成。 蛋白质自我剪接在原核生物和单细胞真核生 物中均已发现。迄今已在20多种生物的近30种蛋 白质分子中发现蛋白内含肽，这些蛋白质大约一 半参与核酸代谢。蛋白内含肽常具有一定的生物 活性，如核酸内切酶的活性。此外，许多蛋白内 含肽插入至蛋白质高度保守区（如活性中心附 近），这一方面迫使蛋白质前体必须经过剪接才 能成熟, 另一方面也有利于蛋白内含肽自我保护。,切除,连接,蛋白质的自我剪接,四、 蛋白质合成所需的能量,蛋白质的合成是一个高耗能过程 AA活化 2个高能磷酸键（ATP） 肽链起始 1个（70S复合物形成，GTP） 进位 1个（GTP） 移位 1个（GTP）,第一个氨基酸掺入需消耗3个(活化2 + 起始1), 以后每掺入一个AA需要消耗4个（活化2个 + 进位 1个 + 移位1个）高能键。,从氨基酸开始合成一个含200个残基的蛋白 质需要消耗多少高能磷酸键? 活化一个氨基酸 -2 2002=400 起始一次 ： -1 形成一个肽键： - 2 1992=398 共消耗高能键 4003981=799,五、活性肽合成的特征 P.285-286,第五节 真核生物与原核生物 蛋白质合成的差异 1. 核糖体更大: 真核生物-80S