般毒性作用及其试验与评价方法1.ppt

第六章 一般毒性作用及其试验与评价方法,毒性作用,一般毒性作用 （急性毒性、亚慢性毒性、慢性毒性）,特殊毒性作用 （ 致突变作用、致癌作用、 致畸作用、遗传毒性）,一般毒性作用(general toxicity)，也称基础毒性(basic toxicity) ：是人和动物单次或反复接触食品毒物或有害因素后在躯体及靶部位所发生或表现出的急性或长期的一般性中毒症状、生理生化变化、组织病变及死亡现象。即毒物对动物机体产生的综合毒效应。 根据毒物接触次数和效应发生时间长短，一般毒性作用可划分为急性毒性、（蓄积毒性）、亚慢性毒性和慢性毒性。,第一节 急性毒性作用及其评价,一、基本概念。（P122） 急性毒性（acute toxicity）是指机体(人或实验动物)一次接触(或24小时内多次接触)受试物后，在短期内所产生的效应及反应，包括一般行为、外观改变及形态改变，甚至死亡效应。 观察时间：一般为7天，也可连续观察1428天。,一次接触 (P122),经口接触和各种方式的注射接触，“一次接触”，是指在瞬间将受试化合物输入实验动物的体内； 而经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次接触”是指在一个特定的期间内实验动物持续地接触受试化合物的过程; 此外，当化学物毒性较低时，需要给予动物较大剂量时，可在24小时内分多次给予，这时的急性接触即为“多次”。,二、急性毒性试验目的 1、测定和计算出急性毒性评价参数 1927年Trevan引入了半数致死量的概念来评价急性毒性，此后，该指标得到广泛应用，并成为急性毒性的主要指标。 2、找出受试物的剂量-效应和剂量-反应关系 3、为毒作用机制研究提供线索。,急性毒性试验可以得到的毒性参数：,绝对致死剂量或浓度(LD100或LCl00) 半数致死剂量或浓度(LD50或LC50) 最小致死剂量或浓度(MLD，LD01或MLC，LC01) 最大耐受剂量或浓度(MTD，LD0或MTC，LC0) 或称为最大非致死剂量(MNLD) 急性毒性LOAEL(观察到有害作用的最低剂量) 急性毒性NOAEL(未观察到有害作用的剂量),急性毒性的下限参数， 非致死性急性毒性 作用为终点,急性毒性的上限参数 以死亡为终点,通过病理组织学和中毒症状观察等手段测定,三、急性毒性试验设计要点,1、实验动物的选择和要求 品种、品系的选择 健康状况：健康成年动物 小鼠、大鼠测半数致死量，狗观察毒性反应。 年龄：大鼠180-240g，小鼠18-25g（35-50日龄），家兔2-2.5kg，豚鼠200-250g，狗10-15kg。 性别：雌、雄各半，雌性实验动物要求是未经交配和受孕的。 各剂量组动物数： 小动物数量为每组10只，大动物也应每组6只。,2、剂量设计与分组 根据受试物或其近似物的物理、化学性质选择与本实验相同动物物种或品系，相同染毒途径的LD50值作为参考值，选择剂量系列。 一般分四组：高中低三个剂量组及一个阴性对照组 3、确定实验动物染毒方法： 灌胃 4、观察周期及观察内容 观察周期：一般为14天或24h，但计算出LD50时应注明,急性毒性试验的观察内容（P132） 中毒出现的时间和症状 死亡时间及死亡数计算LD50 剖检、生化及病理学检查 毒代动力学分析,啮齿类动物急性毒性试验主要的观察项目,5、LD50的计算方法：,（1）改进寇氏法 P127 改进寇氏法：计算简便，结果可靠。 试验设计要求：组内动物数相等、组间剂量等比例设计、死亡率正态分布、最低剂量组死亡率80% 计算公式：logLD50=X- i(p - 0.5) X-最高剂量组对数值 i - 组距（相邻两组剂量对数值之差） p - 死亡率总和,（2）霍恩法 优点：简单易行，使用动物少 缺点：可信范围大，不够精确 特点： 每组动物数是固定的，每组4只或5只 剂量是固定的，有两种系列： 10，21.5，46.4 ，100，215，464，1000 10，31.6，100，316，1000，3160， 即每个剂量组之间的剂量差距只能是2.15倍或3.16倍,应用程序： 确定每组动物数，一般大小鼠5只，家兔4只 确定剂量系列，常用的系列为： 1.0010t(t=0、1、2) 2.1510t 4.6410t 10.010t 预试验：如采用10，100，1000mg/kg的剂量 LD50可能在100-1000mg/kg 不见死亡 全部死亡 正式试验：选择100，215，464，1000mg/kg（t=2）四个剂量组 观察并记录死亡数、死亡时间及中毒症状等。 如 死亡数为1，1，3，4 查表：根据动物死亡数查表（P366）求得LD50 LD502.78102278（125-619）mg/kg,四、急性毒性的分级与评价（P134）,急性毒性评价的最主要的依据就是LD50,急性毒性评价,剂量达10g/kg体重以上，仍不引起死亡认为该受试物的急性毒性试验是安全的 急性毒性LD50或7天在喂养试验的最小有作用剂量小于人的可能摄入量的10倍表面该受试物急性毒性较大，应予以放弃，不再继续试验 急性毒性LD50大于人可能摄入量的10倍该受试物可进入下一阶段的试验 急性毒性LD50在人可能摄入量的10倍左右重复试验,LD50虽然是评价急性毒性的最重要指标，但仅凭LD50进行急性毒性评价是不完善的。因为仅仅LD50一个指标只能反映急性毒性的大小，并不能反映毒性的其他特征。因此，在评价和报告化学物急性毒性时，除LD50外，还应报告LD5095%可信限范围、急性毒作用带等指标，并尽可能详尽描述中毒特征、症状表现、出现时间、死亡前兆、毒性作用的发生、发展、恢复经过，以及体重、剖检和病理学变化等。从而较全面地对急性毒性做出评价。,免费茶水的重金属严重超标,一份外国学者的研究指出， 中国13个品牌的香烟重金属含量超标,第二节 蓄积毒性,一、基本概念 P138 当化学毒物连续、反复进入机体，而且进入的速度（或总量）超过代谢转化与排出的速度（或总量）时，物质就有可能在体内逐渐增加并贮留的现象-蓄积作用（accumulation） 化学毒物容易蓄积的组织和器官贮存库,蓄积 作用,物质蓄积（material accumulation）： 指机体少量反复多次接触毒物后，该毒物在机体内逐渐积累。,功能蓄积（functional accumulation）： 指机体少量反复多次接触毒物后，每次引起的轻微功能损害逐渐积累，当积累到一定程度时出现毒性效应。,蓄积作用的毒理学意义： 发生慢性中毒的物质基础 评价该毒物能否引起慢性中毒的依据之一 制订卫生标准时选择安全系数的主要依据,如：有机氯农药DDT和六六六、重金属铅的危害主要是它们的蓄积作用所造成的慢性毒性。,二、蓄积毒性试验方法,蓄积系数法 生物半减期法,蓄积系数法,蓄积系数是指多次染毒使半数动物出现效应（或死亡）的蓄积剂量ED50(n)与一次染毒使半数动物出现相同效应（或死亡）的剂量ED50 (l)的比值。 K =ED50(n) /ED50 (1) （以出现生物效应或特异性损伤为指标） 或K =LD50(n) /LD50 (1) （以死亡为指标） n多次接触受试物时产生预期效应的蓄积剂量的总和 1一次接触该物质产生相同效应的一次剂量,蓄积系数分级标准：,K =ED50(n) /ED50 (1),或K =LD50(n) /LD50 (1),蓄积系数法常用的实验方案：,固定剂量法 剂量递增法 剂量固定的20天蓄积法,剂量递增法使用剂量表：,蓄积毒性试验的目的：,求出外源化学物的蓄积系数，了解蓄积毒性大小 为慢性毒性试验和其它有关毒性试验的剂量选择提供参考依据 为制定有毒物质在食品中的卫生限量标准时，为安全系数的选择提供参考 确定该受试物可否用于食品供人类长期食用,三、机体的耐受性,机体对化学物的耐受性：一些化学物在体内蓄积到应该产生中毒反映的剂量时却没有出现中毒反应，必须再加大剂量才能出现预期的中毒反应的现象。 机体对化学物的蓄积和耐受往往是同时存在的！ 农药、兽药残留！,第三节 亚慢性毒性作用,一、基本概念 定义：亚慢性毒性是指实验动物连续多日接触较大剂量的外源化学物所出现的中毒效应。 较大剂量 - 没有明确的剂量范围下限 但剂量上限急性LD50。 较长时间 - 通常为36个月，由试验的目的而定。,亚慢性毒性试验目的： 主要是为慢性毒性试验做准备！,1、确定其观察到有害作用的最低剂量（LOAEL）和未观察到有害作用的剂量（NOAEL），初步提出这种受试物的安全限量参考数值。 2、确定受试物亚慢性毒性的效应谱，毒作用特点和靶器官。 3、研究受试物亚慢性毒性损害的可逆性。 4、为慢性毒性试验的剂量设计及观察指标选择提供依据。 5、为在其它试验中发现的或未发现的毒作用提供新的信息，比较不同动物物种毒效应的差异，为受试物毒作用机制研究和将研究结果外推到人提供依据。,二、亚慢性毒性试验设计的要点,（一）试验动物的选择 1、物种品系：啮齿类、非啮齿类 2、性别：雌雄各半 3、年龄/体重：断乳不久的动物 如大鼠80100g（21-23日龄），小鼠15g左右（18-21日龄） 4、动物数：大小鼠每组20只，犬猴每组6只； 5、环境要求：应使用SPF及以上等级动物；符合国家实验动物标准的实验环境。,（二）染毒方式,一般采用经口、经呼吸道、经皮肤染毒 经口染毒多采用掺入饲料法 两个基本原则： 尽量模拟人类在环境中接触该化学物的途径或方式； 应与预期进行慢性毒性试验的接触途径相一致。,（三）剂量分组,至少设四组：3个剂量组和1个阴性对照组 高剂量组 以急性毒性试验的阈剂量或以LD50为参考 应能引起明显的毒性或少量动物死亡（10%） 中剂量组 相当于观察到有害作用的最低剂量（LOAEL） 低剂量组 应无中毒反应，相当于未观察到有害作用剂量（NOAEL），可依据急性毒性的阈剂量或急性LD50的1/201/5确定,（四）观察指标,1一般性指标： （1）外观体征、行为活动：每日观察、记录 （2）体重：一般每周称重一次 （3）饲料消耗量：每周记录，计算食物利用率 食物利用率是指动物每食入100g饲料所增长的体重克数。 （4）异常表现、中毒症状 2实验室检查：血象检查、尿液；肝、肾功能的检测 3病理解剖学和组织学检查 4其他指标,观察指标,三、亚慢性毒性作用的评价,亚慢性毒性无作用剂量（NOAEL）人的可能摄入量的100倍，表示毒性很强，放弃该化学物的使用； 在100300倍之间的，可进行慢性毒性试验 如300倍的不必进行慢性毒性试验，可直接进行毒性评价,第四节 慢性毒性作用及其试验,一、基本概念 慢性毒性是指实验动物长期小剂量反复接触受试物所引起的毒性效应。 长期：小鼠一般为18个月（寿命1-2年），大鼠为24个月（寿命2-3年），其他动物2年，甚至终身。,二、慢性毒性试验设计,（一）实验动物的选择 1、物种品系：啮齿类、非啮齿类 2、性别：雌雄各半 3、年龄/体重：初断乳动物 如大鼠5070g，小鼠1015g左右 4、动物数：大小鼠每组4060只，犬猴每组812只,繁殖特性：小鼠成熟早，繁殖力强，寿命1-3年。新生仔鼠周身无毛，通体肉红，两眼不睁，两耳粘贴在皮肤上。一周开始爬行，12天睁眼，雌鼠35-50日龄性成熟，配种一般适宜在65-90日龄，妊娠期19-21天，每胎产仔8-12只。,（二）染毒途径：经口染毒，多用饲喂法 染毒期限：小鼠18个月、大鼠2年 （三）剂量设计与分组 3个剂量组和1个对照组，剂量参考亚慢性毒性作用阈剂量或LD50 （四）观察指标 基本同