纳米材料MCM-41的制备及其固定化酶的研究.pdf

第 3 3卷 第 1期 2 0 0 6缸 北 京 化 工 大 学 学 报 J OURNAL 0F BEI J I NG UNI VERS I TY OF CHEMI cAL TE CHNOL OGY Vo 1 3 3 No 1 2 0 0 6 纳米材料 MC M 4 1的制备及其固定化酶的研究 赵炳超 肖 宁 马润宇 石 波 ( 1 北京化工大学生命科学与技术学院。北京1 0 0 0 2 9 ； 2 中国农业科学院饲料研究所，北京1 0 0 0 8 1 ) 摘要：在使用扩孔剂间三甲苯的条件下， 对新型大孔纳米材料 MC M一 4 1进行 了制备， 并对该材料作为载体固定 化木瓜蛋白酶进行了研究。x射线衍射和氮气吸附表征结果表明： 材料内部孔的排列高度有序且孔径集中分布在 6 3 n m附近。用该材料作为载体固定化木瓜蛋白酶的结果表明： 在给酶量、 戊二醛质量分数、 时间、 温度和 p H值分 别为2 O mg g ， 0 7 5 ， 2 h ， 1 0 2 O和 7 0的条件下， 固定化酶的回收率为 5 5 左右， 效果最佳。 关键词 ： 纳米材料 MC M一 4 1 ；固定化； 木瓜蛋白酶；戊二醛 中囝分类号 ： Q 8 1 4 2 在过去的半个多世纪里， 有关酶 固定化的研究 很多 1 - 3 ， 而固定化载体 是影响 固定化酶性 质的重 要因素【 4 5 。纳米材料 MC M一 4 1是 Mo b i l 公 司开发 的 MC M 系列( Mo b i l C o mp o s i t i o n o f Ma t t e r ) 分子筛 中的一类， 具有高度有序、 孔径分布范围很窄的孔 道， 且孔径可在 2 1 0 n m之 间调节【 6 。该 载体不 仅固定酶的量很大， 且使酶分子沿孔道依次分布， 并 未使其堆积在一起 。因此可以使固定化酶表现 出最 大的活性。MC M一 4 1是一种新型的无机类 固定化载 体， 曾有用小 孔 MC M 4 1固定 化木 瓜蛋 白酶 的报 道 8 _， 但由于孔径偏小， 固定化效果不太好。本文 采用加入扩孔剂间三 甲苯 ( TMB) 的方式对 新型大 孔纳米材料 MC M一 4 1进行 了制备 ， 并对以该材 料作 为载体固定化木瓜蛋白酶进行了研究。木瓜蛋白酶 在酿酒工业中主要用于酒液 中蛋 白的脱除以使得酒 液变得透明， 但游离的木瓜蛋白酶与酒液的分离相 对困难， 而经过 固定化的木瓜蛋 白酶则可更方 便地 应用于酿酒工业中。 1 实验 1 1 材料 木瓜蛋白酶、 酪蛋白( S ig m a ) ； 酪氨酸、 半胱氨 酸、 戊二醛 ( 2 5 ， 质量分数 ) 、 E D TA、 Na OH、 三氯 乙 收稿 日期 ： 2 0 0 5 0 3 0 9 第一作者：男， 1 9 7 1 年生。 博士生，副研究员 *通讯联系人 E ma i l ：r ma ma i l b u t t e d u c n 酸( TC A) 、 正硅酸四乙酯 ( TE OS ) 、 十六烷 基三 甲基 溴化铵 ( C T AB ) 、 间三 甲苯( TMB) 、 ( 2 1 6 H 2 0 以 及配制缓冲溶液所用的试剂均为分析纯( 北京化学 试剂公司) ； 实验中所用的磷酸盐、 磷酸盐 碳酸盐以 及碳酸盐缓冲液均为 0 1 m o l L的钠盐； 木瓜蛋白 酶和酪蛋白分别溶解于 p H值 7 0的磷酸缓冲液中 制成质量浓度 1 mg mL和 5 mg mL的溶液 ； 激活剂 是半胱氨酸和 E D T A的浓度分别为2 0 m m o l L和 1 m m o l L的 p H值 7 0的磷酸缓冲液； T C A溶于去 离子水中制成质量分数为 5 的溶液； 戊二醛用去 离子水稀释为 7 5 ， 备用。 1 2 新型大孔纳米材料 MC M 4 1的制备 自上世纪 9 0 年代以来， 有关介孔材料 MC M一 4 1 的制备研究很多 6 - 7 , 9 ， 但多为小孔介孔材料。本文 采用加入扩孔剂的方法来制备大孔纳米材料 MC M 4 1 。首先将 4 4 g C T A B ， 0 8 g N a O H， 0 4 g A1 ( 2 1 3 6 H a O加入 1 8 0 mL水 中， 溶解 完毕后， 向溶 液 中加 入 3 6 g扩孔剂 T MB 。搅拌 3 0 m i n后， 开始滴加 2 0 8 g T E O S ， 滴加时间控制在 3 0 m i n 左右。滴毕 再继续搅拌 1 h ， 生成的胶体溶 液装入 高压反应釜 内， 1 2 0 下反应 4 8 h 。反应完毕， 得到的产品经过 滤、 水洗后， 在 5 5 下干燥过夜， 得到的白色粉末在 5 4 0下煅烧 8h后即可得到最终产品。 1 3 木瓜蛋 白酶在 MC M 4 1上的固定化 将 0 1 g MC M一 4 1 和 5 m L p H 7 0的磷酸缓冲 液加入 2 5 mL的锥形瓶 内， 然后再加入 2 mL的激活 剂和 2 mL的木瓜蛋白酶溶液， 最后向溶液中滴加 7 5 的戊二醛直至溶液中其质量分数为 0 7 5 。 固定化反应在 1 8 0 r m i n ， 1 5 的条件下进行 2 h ， 再 维普资讯 第 1期 赵炳超等： 纳米材料 MC M 4 1的制备及其固定化酶的研究 经过滤 、 5 0 mL p H值 7 0的磷酸液洗涤后得到固定 化酶。 1 4 酶活性的测定 木瓜蛋 白酶 的活性用酪 蛋白作底物、 酪氨酸作 标准物用紫外方法测量。具体操作程序如下： 将 0 5 mL木瓜蛋 白酶溶液与 4 5 mL激活剂混合后， 在 2 5 下预热 1 0 mi n ， 然后与在同样条件下预热 1 0 m i n 的酪蛋白溶液混合， 酶解 1 0 min后加入 5 m L T C A溶液终止酶解反应， 过滤得到的上清液在 2 7 5 n m处测量 紫外 吸光 度 以计 算木 瓜蛋 白酶 的酶 活 性。固定化酶活性测定时除了 0 5 mL木瓜蛋 白酶 溶液用 0 1 g固定化酶放入 0 5 mL磷酸缓 冲液 中 代替外， 其它与上述游离酶的活性测定方法相同。 固定化酶回收率为固定化酶的活性与酶溶液在固定 化前后的活性变化之 比。 2 结果与讨论 2 1 合成材料的表征结果 2 1 1 氮气吸附与孔径分布 用 AS A P 2 0 1 0仪测 定本文所合成的纳米材料的 N2 吸附等温线及其相 应的孔径分布曲线， 结果见图 1 ， 2 。图 1 给出的吸 附等温线为朗格缪型， 是典型的介孔材料的吸附 县 莲 相对压力为绝对压力与标准大气压 ( 1 0 1 3 2 51 0 P a ) 的 比 图 1 合成材料的氮气吸附等温线 Fi g 1 Ni t r o g e n a d s o r p t i o n i s o t h e r m o f a s s y n t h e s i z e d ma t e r i a l 曲线。吸附等温 线内存 在一个 阶跃 吸附区， 说 明所 合成的纳米材料的介孔结构均一。从图 2给出的所 合成纳米材料的孔径分布曲线容易看出， 该材料的 孔径集中在 6 5 n m左右， 孔径分布范围很窄。用 B J H方法计算该材料的孔径 为 6 3 n m。 2 1 2 长 程 有 序度 用 型号 为 D Ma x 2 5 0 0 VB 2 十 p c的 x射线衍射仪测定所合成的纳米材料， 结 果见图3 ， 容易发现 x射线衍射峰形较宽。这可能 由于扩孔剂 T MB的加入使得所合成的纳米材料的 长程有序度下降、 峰形变宽。由此 可以做 出如下推 断： 孔径增大， 则孔的长程有序度下降。 吸附强度为吸附量对孔径的微分值 图2 合成材料的孔径分布曲线 F i g 2 P o r e s i z e d i s t r i b u t i o n c u r v e o f a s s y n t h e s i z e d ma t e r i a l 5 7 9 2 0 ( 。 ) 图 3 合成材料的 x射线衍射曲线 F i g 3 X r a y d i f f r a c t i o n c u r v e o f a s s y n t h e s i z e d ma t e r i a l 2 2 固定化条件的优化 图 4给出了给酶量( 给酶量指固定化时， 固定化 兰 0 目 蛭 谧 给酶量 ( rag g ) 固定化条件： 2 h ； 1 5 ； 戊二醛质量分数， 0 7 5 ： p H 7 0 图4 给酶量对固定化酶活性( O) 及活性 回收率( ) 的影响 F i g 4 E f f e c t o f e n z y me c o n c e n t r a t i o n o n a c t i v i t y( O) a n d a c t i v i t y y i e l d( )o f i mmo b i l i z e d e n z y me 溶液中酶与载体的质量比) 对固定化效果的影响曲 线。 从 图 4可 以看 出： 当给酶量从 1 0 mg g增 加到 2 0 mg g时， 固定 化酶的活性从 5 5 O 0 n mo l s 迅速 增加到 1 0 5 8 3 n m o l s ； 当给酶量从 2 0 m g g 变化到 一 目 口 I 。 ) 暖蓝 维普资讯 l 0 北 京 化工 大学 学 报 2 0 0 6钜 4 0mg g时， 固定化酶 的活性 只是从 1 0 5 8 3 n mo l s 逐渐增加到 1 3 4 O 0 n mo l s ； 当给酶量继续增加 时。 固定化酶的活性开始随着给酶量的增加而下降。这 样的变化规律很可能与 MC M一 4 1 孔道 的容量有关。 当孔道为酶分子所饱和时， 固定化酶活性达到最大， 此后给酶量继续增 加会导致孔道堵塞， 使孔道 内的 酶分子的活性无法表现出来。 引起固定化酶表观活 性的下降。从图 4 还可以发现： 当给酶量从 1 0 m g g变化到 2 0 mg g时， 固定化酶的 活性 回收率 只是 缓慢的下降； 当给酶量超过 2 0 m g g 后， 回收率下降 加快。实验 中发现用于固定化的酶溶液在固定化反 应后几乎没有剩余活性， 这样固定化酶回收率的定 义( 见 1 4 ) 可简化为 ： 固定化酶活性与用于固定化 的酶溶液中初始酶活性之比。根据固定化酶活性随 给酶量的变化规律容易理解固定化酶活性回收率随 给酶量的变化规律。 图 5给出了活性回收率随温度的变化曲线。温 墼 回 莲 固定化条 件 ： 给酶 量， 2 0mg g 2 h ； 戊 二 醛质 量 分 数， 0 7 5 9 6 ； p H 7 0。 图5 温度对固定化酶活性回收率的影响 Fi g 5 Effe c t o f t e mp e r a t u r e o n a c t i v i t y y i e l d o f i mmo b i l i z e d e n z y me 度在 1 0 2 0 时， 活性回收率没有显著变化； 当温 度超过 2 0 时， 活性回收率开始随温度的升高而下 降。因为酶分子在较高的温度下更易失活。此外随 着温度的升高， 酶分子与戊二醛之间的交联反应更 易进行。显然， 发 生交联后的酶分子 比单个酶分 子 更难进入孔道内， 固定化酶活性回收率下降。 图 6给出了固定化 的最佳反应时 间为 2 h 。容 易理解 ： 随着时间的延长。 载体固定化的酶量也在增 加。 固定化反应达到 2 h时， 载体 固定化的酶量达到 最大。如固定化反应继续进行， 更多酶分子的进入 引起孔道堵塞使孔道 内的酶分子不能表 现其活性 。 此外时间越长， 戊二醛引起失活的酶分子也越多， 这 也是固定化酶活性回收率下降的原因之一。 从图 7知道固定化反应的最佳 p H值为 7 0 。 酶 分子通过与载体表面的羟基形成氢键的方式吸附在 载体表面上， 当 p H值为 7 0时， 吸附可能最稳定， 此时载体固定化酶的量最高， 表现出最大的活性。 此外， 酶分子通过戊二醛与载体之间的连接在 p H 值 7 0 时可能最稳定。 从图 8 可以知道， 固定化反应的最佳戊二醛质 固定化条件： 给酶量， 2 0 ra g g ； 1 5 ； 戊二醛质量分数。 0 7 5 ； p H 7 0 图6 时间对固定化酶活性回收率的影响 F i g 6 E f f e c t o f t i me o n a c t i v i t y y i e l d o f i mr t i l i z e d目l 卿e 固定化条件： 给酶量， 2 o m g g ； 2 h ； 1 5 ； 戊二醛质量分数。 0 7 5 图 7 p H对固定化酶活性 回收率的影响 F i g 7 E f f e c tof p i t on a c t i v i t yyie l d o fi mr a o b fl i z e d目l 卿e 固定化条 件： 给酶量， 2 0ra g g ； 2h ； 1 5 ； p H 7 0 图 8 戊二醛质量分数对固定化酶活性回收率的影响 Fi g 8 Effe c t o f g l u t a r a l d e h y d e c o n c e n t r a t i o n o n a c t i v i t y y i e l d o f i mmo b i l i z e d e n z y me 量分数 为 0 7 5 ， 随着戊二醛 从 0 1 0 变 化到 0 7 5 ， 活性回收率也从 1 4 上升到 5 5 ， 增长了 近四倍。在酶的固定化反应 中， 戊二醛用作交联剂。 随着戊二醛质量分数的增加， 载体固定化的酶量也 在增加， 固定化酶的活性及其活性 回收率也相应增 加。与此同时， 随着戊二醛质量分数的增加， 溶液中 维普资讯 第 1期 赵炳超等： 纳米材料 MC M一 4 1 的制备及其固定化酶的研究 的酶分子与戊二醛更易发生交联， 交联后的酶分子 较单个酶分子更难进入孔遭 内， 最终导致 固定化酶 活性回收率的下降。此外戊二醛不仅是交联剂， 还 会引起酶失活。随着其浓度的增 加， 酶分子也更易 失活。综 上所述， 当 戊二醛 质量分 数低 于 0 7 5 时， 其综合作用对酶固定化有利， 随着戊二醛质量分 数的增加， 固定化酶的活性 回收率不断上升 ； 当戊二 醛质量分数高于 0 7 5 时， 其综合作用不利于酶的 固定化， 随着戊二醛质量分数的增加， 固定化酶 的活 性回收率逐渐下降。 3 结论 本文对大孔 纳米材料 MC M一 4 1的制备 及其作 载体固定化木瓜蛋白酶进行了研究。合成材料的表 征结果证 明孔径分布集中在 6 3 n m 附近， 晶相结构 相对完整。以该材料 固定化木瓜 蛋 白酶的研究表 明： 在给酶量、 戊二醛质量分数、 时问、 温度和 p H值 分别为 2 0 mg g ， 0 7 5 ， 2 h ， 1 0 2 0 和 7 0的条 件下， 固定化酶效果最佳， 活性回收率达 5 5 左右。 参考文献 1 P o we l l L WD e v e l o p me n t s i n i mmo b i l i z e d - e n z y me t e e h n o l o g y J B i o t e c h n o l o g y& G e n e t i c E n g i n e e r i n g R e v i e ws ， 1 9 8 4，2： 4 0 9 4 3 8 2 S u n d a r a m P V，P y e K E R e c o mme n d a t i o n s f o r s t a n d a r d i z a t i o n o f n o me n c l a t u r e C P y e K E 。Wi n g a r d L B En z y me En g i n e e r i n g Ne w Yo r k a n d L o n d o n： P l e n u m P r e s s ，1 9 7 4 ，4 4 9 4 5 2 Tr e v a n M DI mmo b i l i z e d En z ym e s An i n t rod u c t i o n a n d a p p l i c a t i o n s i n b i o t e c h n o l o g y M Ne w Y o r k B r i s b a n e a n d To r o n t o：J o h n Wi l e y a n d S o n s ，1 9 8 0 Ku r i t a K，Yo s h i n o H，Ni s h i mu r a S I ，e t a 1 A n e w t y p e o f s u p p o r t s f o r e f f e c t i v e i mmo b i l i z a t i o n o f a c i d p h o s p h a t a s e J C a r b o h y d r a t e P o l ym e r s ，1 9 9 7 ，3 2 ： 1 7 1 17 5 I v a n o v a V， Do b r e v a E C a t a l y t i c p r o p e r t i e s o f immo b i l i z e d p u ri f i e d t h e r mo s t a b l e口 一 a my la s e f r o m b a c i l l u s l i c h e n i f o r mi s 4 4 MB 8 2 一 A J P r o c e s s B i o c h e mi s t r y ， 1 9 9 4 。2 9： 6 0 7 6 1 2 Kr esg e C T，L e o n o wi e z M E，Ro t h W J ，e t a 1 Or d e r e d me s o po r o u s mo l e c u l a r s i e v e s s y n t h esi z e d b y a l i q u i d - c r y s t a l t e mp l a t e me c h a n i s m J N a t u r e ，1 9 9 2 。3 5 9 ： 7 1 0 71 2 B e c k J S ，Va rtu l i J C，Ro t h W J 。e t a 1 A n e w f a mi l y o f me s o p o rou s mo l e c u l a r s i e v e s p r e p a r e d wi t h l i q u i d c r y s t a l t e m p l a t e s J J o u r n a l o f t h e A me r i c a n C h e mi c a l S o c i e t y ，1 9 9 2，1 1 4： 1 0 8 3 4 1 0 8 4 3 Di a z J F，Ba l k u s K J ，J r En z y me i mmo b i l i z a t i o n i n MC M- 4 1 mo l e c u l a r s i e v e J J o u r n a l o f Mo l e c u l a r Ca t a l y s i s B - En z y ma t i c ， 1 9 9 6 ，2： 1 1 5 1 2 6 禹剑，王连洲。施剑林， 等低表面活性剂 硅比率中 有序介孔材料的合成 J 无机材料学报。2 0 0 0 ，1 5 ( 1 ) ： 5 56 1 Pr e p a r a t i o n o f n a n o po r o u s ma t e r i a l M CM 4 1 a s we l l a s i mm o b i l i z a t i o n o f pa p a i n o n i t Z HAO Bi n g c h a o XI AO Ni n g MA Ru n y u S HI I 3 o 2 ( 1 C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y 。B e ij i n g Un i v e r s i t y o f Ch e mi c a l T e c h n o lo g y 。B e ij i n g 1 0 0 0 2 9 ； 2 F e e d R e s e a r c h I n s t it u t e 。C h in e s e Ac a d e my o f A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s 。B e ij in g 1 0 0 0 8 1 ，C h i n a ) Ab s t r a c t ：Th e p r e s e n t wo r k d e a l t wi t h t h e p r e p a r a t i o n o f n a n o p o r o u s ma t e r i a l MCM一 4 1 wi t h me s i t y l e n e b e i n g a s we l l i n g a g e n t a s we l l a s t h e i mmo b i l i z a t i o n o f p a p a i n o n t h e a s s y n t h e s i z e d ma t e r i a l wi t h t h e a i d o f a c o u p l i n g a g e n t ，g l u t a r a l d e h y d e I