能源甜菜酒精发酵的工艺优化及数学模型.pdf

第 25 卷 第 6 期农 业 工 程 学 报Vol.25No.6 2142009 年6 月Transactions of the CSAEJun. 2009 能源甜菜酒精发酵的工艺优化及数学模型 史淑芝 1,2，程大友2，徐德昌2，马凤鸣1，鲁兆新2， 董爱军 2，代翠红2，罗成飞2 （1东北农业大学农业部寒地作物生理生态重点开放试验室，哈尔滨 150056； 2哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，哈尔滨 150090） 摘要：利用菌种 ADY（Saccharomyces cerevisiae）对能源甜菜 NY0503 进行酒精发酵。应用 Plackett- Burman 设计法从 底物浓度、料液比、加菌量、营养盐添加量、加磷量、pH 值、转速、发酵温度和发酵时间 9 个因素中筛选出了加磷量、 发酵温度和底物浓度为主要影响因素，并用响应面分析法求出回归方程。结果表明，经优化后最佳工艺条件为：底物浓 度 12%、料液比（质量比）11、加菌量 15%、营养盐添加量 0.5、加磷量 1.9%、pH 5.0、转速 130 r/min、发酵温度 31 和发酵时间 44 h，共进行 5 批次验证试验，结果为酒精转化率的平均值为 95.48%，与模型的理论值 96.54%的差值仅占 理论值的 1.09%，进一步说明所建立的模型是切实可行的。 关键词：酒精发酵，工艺优化，数学模型，能源甜菜 doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2009.06.040 中图分类号：TS261.4文献标识码：A文章编号：1002-6819(2009)-6-0214-05 史淑芝，程大友，徐德昌，等.能源甜菜酒精发酵的工艺优化及数学模型J. 农业工程学报，2009，25(6)：214218. Shi Shuzhi, Cheng Dayou, Xu Dechang, et al. Technological optimization and mathematical model of alcohol fermentation of energy beetJ. Transactions of the CSAE, 2009,25(6)：214218.(in Chinese with English abstract) 0引言 随着全世界能源的不断扩展，可再生的生物质能源 将是本世纪主要的能源物质1- 4。从 20 世纪 70、80 年代 开始，世界上许多国家就开始寻求利用可再生的生物质 进行能源开发5。而随着我国经济的飞速发展，能源的消 耗越来越大，石油资源的短缺，长期供应能力不足的问 题日显突出6。 酒精是一种可再生能源,也是石化燃料最有希望的替 代产品7,8。这在世界上许多国家的人们都已达成共识。 但怎样才能找到一种适宜的能够产生酒精的可再生的生 物质，又摆在人们面前。 甜菜作为糖料作物早已为人类所利用， 从 20 世纪 90 年代末开始，由于受世界食糖市场不稳定和石油能源紧 张的影响，少数发达国家便开始尝试选育能源甜菜的研 究9。由于能源甜菜是新兴的可再生能源作物10，它具有 生物学产量高，含糖量适中等特点，是环保能源，又是 糖饲兼收的作物11。同时，利用能源甜菜发酵生产燃料 酒精还具有良好的环境效益和经济效益。 利用能源甜菜进行酒精发酵，主要是对筛选所得到 的其组分适于酒精发酵的甜菜块根进行研究。本研究针 收稿日期：2008- 10- 28修订日期：2009- 12- 30 基金项目： 农业部寒地作物生理生态重点开放试验室开放基金： 国家科技部 专项基金（NCSTE- 2006- JKZX- 022） 作者简介：史淑芝（1967） ，女，博士研究生，副研究员，研究方向：植 物生理及农产品深加工。 哈尔滨市南岗区海河路 202 号哈尔滨工业大学食 品学院 2649 信箱，150090。Email: 通讯作者：马凤鸣（1947） ，男，教授，博士生导师，从事作物生理研 究。哈尔滨市香坊区木材街 59 号东北农业大学农学院，150030。 Email: Fengming_ 对酒精发酵过程中存在的共性技术难题开展研究，研究 利用能源甜菜块根发酵生成酒精的最佳工艺参数，建立 适宜的数学模型12，最终获得较高的酒精转化率，从而 为工业化生产和提高经济效益提供理论依据。 1材料与方法 1.1试验材料 材料：能源甜菜 NY0503。 供试菌种：ADY（Saccharomyces cerevisiae） 。 试剂：AlCl36H2O，(NH4)2SO4，Mg SO4，KH2PO4， CaCl2，过磷酸钙，盐酸，蒸馏水。 仪器及用品：500 mL 容量瓶，100 mL 量筒，自制锯 糊机， VENEMA 甜菜检糖自动线， 天平， pH 计， DH5000 型恒温培养箱，HZQ- F160A 型恒温振荡培养箱，EYELA N- 1000 旋转蒸发仪，酒精计。 1.2试验方法 1.2.1发酵底物制备 每个处理设 3 个平行试验，按以下顺序及方法进行。 1）制糊：取切削标准的 NY0503 甜菜块根洗净后用 自制的锯糊机加工成糊状，充分混匀。 2）蔗糖测定及配制底物浓度：用荷兰进口的 VENEMA 甜菜检糖自动线检测样品的蔗糖含量，具体做 法为：先配制 AlCl3溶液，使其含量为 85 g/L，待使用前 将其稀释 47 倍达 1.81 g/L 后作为浸提液使用；浸糖时用 26 g 甜菜糊加入 177 mL 浸提液，充分搅拌后用甜菜检糖 自动线检测样品的蔗糖含量，然后根据其蔗糖含量将样 品分别配制成 12%和 15%的底物浓度。 3） 配制料液比： 取 100 g 甜菜糊放入 500 mL 三角瓶 内， 用蒸馏水按试验要求分别配成 10.5 和 11 的料液 第 6 期史淑芝等：能源甜菜酒精发酵的工艺优化及数学模型215 比（质量比） 。 4）杀菌：在每个三角瓶内分别加入药料比为 0.004% 的五氯苯酚钠，混匀后将三角瓶放在 50的摇床内以 180 r/min 的转速杀菌 30 min13。 5）添加营养盐：每种营养盐的添加量见表 1。 表 1营养盐的添加量 Table 1Addition amount of nutrition saltsgL- 1 水平(NH4)2SO4MgSO4KH2PO4CaCl2 0.50.552.52.5 111055 6）调整磷含量：将过磷酸钙溶解，再加入到每个三 角瓶中使其终浓度达到试验所要求的 1%或 2%水平。 7）调节 pH 值：用酸度计对每个三角瓶内的样品用 浓盐酸进行 pH 值调节，最终达到试验方案的要求。 8）加菌：将活化好的菌种按试验方案要求分别以 10%或 15%的菌量加到每个三角瓶中，然后混匀。 9）称重：最后用天平将每个培养瓶进行称量，并记 录数据，以便进行发酵过程控制的 CO2失重测定。 1.2.2酒精发酵 首先，将已制备好的三角瓶放在 28的摇床培养箱 中，以 150 r/min 的转速培养 4 h，并将瓶塞旋松，使部分 氧气进入，以使酵母菌在有氧条件下快速繁殖。 然后，再将培养箱温度分别调至 31和 35，转速 分别调至 100 r/min 和 130 r/min，使培养瓶在近乎厌氧条 件下进行酒精发酵达到试验所要求时间， 并且每隔 6 h 测 定一次 CO2失重量。 最后，以 CO2失重小于 0.1 g/h 时视为发酵终止，将 三角瓶取出，进行蒸馏14。 1.2.3酒精蒸馏及测定 将成熟的发酵醪全部倒入 500 mL 的圆底烧瓶中， 并 将旋转蒸发仪的水浴锅温度调至 52，缓慢蒸发，以使 发酵所产生的酒精尽可能全部蒸出；最后将收集瓶中的 馏出液定容至 100 mL，混匀后倒入 100 mL 量筒中,用酒 精计 （标温 20） 测酒精度（下缘为准） ，同时测定温度， 然后换算成 20时的酒精度。每个处理做 3 次平行试 验15。 1.2.4酒精转化率计算方法 = mLg/mL g%53.8 100% 酒精转化率 发酵醪体积() 发酵醪酒精含量(体积百分数) 相应密度() 发酵底物质量( ) 含糖率( ) 式中53.8100 g 蔗糖理论上转化为酒精的质量，g。 1.3试验设计 应用 SAS（Statistical Analysis System）V8.2 统计分 析软件进行试验设计和分析。 1.3.1Plackett- Burman（P- B）设计 Plackett- Burman（P- B）设计法是一种近饱和的两水 平试验设计方法。它能用最少试验次数估计出因素的主 效应，以从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重 要的几个因素，供进一步研究16。 应用 Plackett- Burman（P- B）试验设计法筛选重要因 素，并根据有关参考文献和单因素试验的结果9，设计 Plackett- Burman（P- B）试验因素及水平，如表 2 所示。 表 2Plackett- Burman（P- B）设计的试验因素与水平 Table 2Experimental factors and levels of Plackett- Burman(P- B) design 水平 因素 - 11 底物浓度/%1215 料液比1:0.51:1 加菌量/%1015 营养盐0.51 加磷量/%12 pH 值4.55.5 转速/rmin- 1100130 发酵温度/3135 发酵时间/ h4460 注：1）营养盐的添加为水平值，无单位；2）发酵时间在 4460 h 之间， CO2失重均小于 0.1 g/h，酒精转化率稍有降低，但到 60 h 以后酒精转化率 急剧下降，故设这两个水平。 1.3.2Box- Behnken 设计及响应面分析 根据 Plackett- Burman（P- B）试验设计法所筛选出的 3 个重要因素，利用 SAS V8.2 统计分析软件进行试验 Box- Behnken 设计，并进行响应面分析，从而确定 3 个重 要因素的最佳水平。 2结果与分析 2.1根据 PlackettBurman 设计法筛选重要因素 本文根据以前的研究和文献报道17，选用试验次数 N=12的试验设计，对底物浓度（X1）、料液比（X2）、 加菌量（X3）、营养盐（X4）、加磷量（X5）、pH（X6）、 转速（X7）、发酵温度（X8）和发酵时间（X9）9个因素 进行考察，响应值为酒精转化率（Y）。发酵试验设计及 试验结果见表3。 表 3Plackett- Burman 试验设计表及响应值 Table 3Plackett- Burman design table and response values 序号X1X2X3X4X5X6X7X8X9Y/% 11- 11- 1- 1- 111176.15 211- 11- 1- 1- 11174.79 3- 111- 11- 1- 1- 1197.43 41- 111- 11- 1- 1- 182.28 511- 111- 1- 1- 1- 197.44 6111- 111- 11- 191.33 7- 1111- 111- 1190.15 8- 1- 1111- 111- 192.95 9- 1- 1- 1111- 11187.46 101- 1- 1- 1111- 1187.36 11- 11- 1- 1- 1111- 187.02 12- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 1- 189.10 注：底物浓度（X1）、料液比（X2）、加菌量（X3）、营养盐（X4）、加磷 量（X5）、pH（X6）、转速（X7）、发酵温度（X8）和发酵时间（X9）9 个 因素进行考察，响应值为酒精转化率（Y）。 采用 SAS V8.2 进行各因素主效应分析结果见表 4。 可见针对 ADY 菌种， 发酵起重要作用的 3 个因素依 216农业工程学报2009 年 次为加磷量，底物浓度和发酵温度，这 3 个因素均达到 了 95%的显著水平；而加磷量的效应值为正值，底物浓 度和发酵温度的效应值为负值，这在下一步水平设计时 需要充分考虑。 进而从表 4 的估计效应和 t 值两列中也可 以发现：发酵过程中加入磷量的多少对试验结果影响极 大，另外发酵温度和底物浓度对最终转化率影响也较大。 表 4统计分析结果 Table 4Results of statistic analysis 因素 符号 因 素 估计 效应 标准差t 值P 值排序 X1底物浓度- 5.79330.1812- 4.90480.03912 X2料液比3.810.18123.22560.08425 X3加菌量1.18670.18121.00470.42097 X4营养盐- 0.55330.1812- 0.46850.68558 X5加磷量9.080.18127.68740.01651 X6pH 值- 0.37670.1812- 0.31890.78009 X7转速1.44670.18121.22480.34536 X8发酵温度- 5.67670.1812- 4.80600.04073 X9发酵时间- 4.46330.1812- 3.7780.06344 注：表中标准差是针对整个实验的处理误差，故为同一值。 2.2应用响应面分析法确定重要因素的最佳水平 2.2.1试验因素水平设计 通过上述 Plackett- Burmen 设计得到的结果可知，各 因素水平可按表 4 中的效应值选取适当的水平，并分析 出：针对 ADY 菌种，加磷量，发酵温度和底物浓度为影 响酒精发酵结果的 3 个主要因素，根据其效应值的大小 和正负按排响应面试验 3 个因素和水平如表 5。 表 5响应面分析试验因素与水平 Table 5Experimental factors and levels of Response Surface Methodology(RSM) 水平 编号因素 - 101 X5加磷量/%11.82.5 X8发酵温度/283133 X1底物浓度/%81215 2.2.2响应面分析试验设计及结果 由表6可见：本试验共通过15次试验来完成，其中12 次试验为析因点分析试验，并设置三次中心点重复试验， 用来估计试验误差；以酒精的转化率为响应值，根据表6 中Box- Behnken设计的试验结果， 运用SAS软件对表6的结 果进行二次回归分析，得到二次回归方程Y= 96.14333 + 2.8075X5- 1.4375X8- 2.48X1- 11.96667X5X5- 0.565X5X8+ 0.29X5X1-5.72666X8X8-1.905X8X1- 9.481667X1X1，回归 方程方差分析及模拟可信度分析结果见表7和表8。 从方差分析表7可以看出模型在 =0.01 水平上回归 显著，一次项、二次项对响应值有显著性影响，但交互 项影响不显著，说明所选因素之间的交互作用不明显， 采用该模型时可以不考虑因素间的交互作用；失拟项反 映的是试验数据与模型不相符的情况， P=0.2805720.1， 说明失拟不显著，因此证明模型选择正确。 从表8可见：决定系数R2为98.64%，说明此模型可以 解释98.64%试验所得的酒精转化率的变化，表明方程拟 合程度较好。而Y的变异系数CV则表示试验的精确度， CV值越高，试验的可靠性越低，本试验中CV=2.043647， 数据较低，说明此试验操作可信。综上说明该回归方程 为能源甜菜固态发酵产生酒精预测提供了一个合理的模 型。 表 6响应面分析试验设计及发酵结果 Table 6Design of RSM and fermentation results 序号X5X8X1响应值 Y/% 1- 1- 1077.23 2- 11073.45 31- 1084.58 411078.54 50- 1- 182.45 60- 1180.26 701- 185.42 801175.61 9- 10- 174.44 1010- 178.87 11- 10169.94 1210175.53 1300096.52 1400097.08 1500094.83 表 7回归方程的方差分析 Table 7Analysis of variance for regression equation 变异来源自由度平方和方差F值P值 X5163.0564563.0564522.646710.005065 X8116.5312516.531255.9371950.058897 X1149.203249.203217.671320.008459 X5X51528.7426528.7426189.89780.0001 X5X811.27691.27690.4585980.52834 X5X110.33640.33640.1208180.742303 X8X81121.0882121.088243.488790.001205 X8X1114.516114.51615.2134550.071244 X1X11331.9459331.9459119.21830.000112 模型91011.583112.398240.367780.000387 一次项3128.790942.930315.418410.00584 二次项3866.6631288.8877103.7540.0001 交互项316.12945.3764671.9309570.242783 误差项513.921772.784353 失拟项311.17773.72592.7156050.280572 纯误差22.7440671.372033 所有项141025.505 表 8模型可信度分析 Table 8Fit statistics for the model 平均值决定系数R2校正后的R2模型误差的平方根 Y的变异系数CV 81.6598.64%96.20%1.6686382.043647 注：表中的81.65为所有响应值的平均值。 2.2.3响应面分析及试验因素的最佳水平确定 通过回归方程绘制分析图，研究所拟合的相应曲面 的形状， 响应面立体分析图和相应等高线图， 分别见图1、 图2和图3。从图1、2、3中及软件分析可见，回归方程存 第 6 期史淑芝等：能源甜菜酒精发酵的工艺优化及数学模型217 在稳定点，同时稳定点为极大值。从图1、图2和图3的等 高线图中可以看出：其等高线图近乎为圆形，说明任意 两因素间交互作用不显著；而从线条的疏密程度可以得 出：X5（加磷量）比X8（发酵温度）和X1（底物浓度）对 响应值所起的作用要大， 而X8和X1对响应值所起的作用差 异不明显。 图1Y=f(X5, X8)响应面立体分析图和等高线图 Fig.1Response surface and contours of adding phosphor and fermentation temperature 图2Y=f(X5, X1)响应面立体分析图和等高线图 Fig.2Response surface and contours of adding phosphor and substrate concentration 图3Y=f(X8, X1)响应面立体分析图和等高线图 Fig.3Response surface and contours of fermentation temperature and substrate concentration 通过岭脊分析得到，Y 值的预测极大值为 96.54%， 而该预测值的标准误为 0.9516，表明该试验达到了显著 水平；极大值所对应的 3 个主要因素（X5，X8，X1）的编 码值及对应量见表 9。 表 9岭脊分析因素与水平 Table 9Factors and levels for ridge analysis 因素编码值Y/% X50.118521.88 X8- 0.1117730.66 X1- 0.1177411.53 2.2.4验证试验 根据实际情况分别将加磷量 （X5） ，发酵温度 （X8） ， 底 物浓度（X1）的水平定为加磷量 1.9%,发酵温度 31，底 物浓度 12%。在以上优化条件下进行验证试验，共进行 5 批次 500 mL 摇瓶试验，酒精转化率平均结果为 95.48%， 该试验值（95.48%）与模型的理论值（96.54%）的差值 仅占理论值的 1.09%， 可见该模型可以较好地反映出利用 ADY 菌种将能源甜菜 NY0503 块根转化成酒精的条件。 3结论 1）从底物浓度、料液比、加菌量、营养盐添加量、 加磷量、pH、转速、发酵温度和发酵时间 9 个与发酵相 关的因素中筛选出加磷量、发酵温度和底物浓度 3 个主 要影响因素。 2）利用响应面分析法优化后最佳工艺条件为：底物 218农业工程学报2009 年 浓度 12%、料液比 11、加菌量 15%、营养盐 0.5、加磷 量 1.9%、pH 5.0、转速 130 r/min、发酵温度 31和发酵 时间 44 h。 3）优化条件下验证试验结果为：酒精转化率的平均 值为 95.48%， 与模型的理论值 96.54%的差值仅占理论值 的 1.09%，进一步说明所建立的模型是切实可行的。 参考文献 1路 明开发生物质能源发展能源农业N人民日报， 2005- 06- 20 2Berndes G, Hoogwijk M, Broek R. 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