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文档简介
中和抗体试验,2008-12-15,SDEPI e-mail: Tel病毒分离技术(四) 中和抗体测定,目的 评价人群中抗脊灰病毒的免疫状态。 评价OPV的有效性和免疫效果。 适用范围 人群脊髓灰质炎中和抗体效价的测定。 免疫成功率的监测。,病毒分离技术(四) 中和抗体测定,必备材料 待检血清(灭活处理) 稀释液(MM) 细胞悬液510104/ml 标准血清 (WHO CDC/EPI) 标准病毒(Sabin ) (滴度106.0CCID50/ml),必备材料 96孔微量板 微量可调式移液器 无菌吸尖/无菌吸管 无菌1.5ml离心管/试管 封板胶带 CO2孵箱,病毒分离技术(四) 中和抗体测定,待检血清稀释(1411024) 每份待检血清的稀释在型板的第1排进行。 0.15ml稀释液,加入 0.05ml的血清,吹吸均匀后,将这个稀释度的血清向下一个稀释度移0.05ml,至最高稀释孔吹吸均匀后,弃去0.05ml。 (在微量板上进行,板子标记和稀释详见附录1),病毒分离技术(四) 中和抗体测定,待检血清稀释方法示例:,病毒分离技术(四) 中和抗体测定,待检血清稀释 用排枪向第2排孔及、型板的相应稀释度的两排孔中,每孔移入0.025ml,原稀释孔保留0.025ml。 标准血清稀释(根据血清效价而定) standard serum: 18000 standard serum : 12000 standard serum : 12000,病毒分离技术(四) 中和抗体测定,标准毒株稀释(200CCID50/0.025ml) (病毒滴定及攻击病毒含量的计算与稀释见附录2、3) 中和试验时所用抗原量过大或过小都会影响血清抗体滴度。每次试验应设病毒对照,核对所用病毒剂量,一般应在32320CCID50/0.025ml的用量时其结果才被认可。 (病毒滴定对照见附录4),病毒分离技术(四) 中和抗体测定,中和作用, 向血清板上加入已稀释好的标准毒株悬液0.025ml (200CCID50) 。 (注意型别的区分和对应) 轻摇混匀后,放入CO2孵箱,培养24小时 加入事先准备好的细胞悬液0.1ml/孔 Hep-2 : 510104/ml 再次摇匀,密封好放在36.5培养57天。,病毒分离技术(四) 中和抗体测定,对照的设立 血清对照( 14),标准血清和待检血清同时设立 细胞对照、稀释液对照 100CCID50的抗原对照 每个对照设两孔,血清、抗原的量各为0.025ml/孔,补加稀释液0.025ml/孔,细胞对照孔的稀释液应为0.05ml,然后全部加细胞悬液0.1ml/孔,密封后放34.5培养57天。,病毒分离技术(四) 中和抗体测定,结果判定 当100CCID50的抗原对照出现完全病变时,判定最终结果 当最高稀释度的血清病毒混合液接种的2孔细胞中有1孔不出现CPE,该稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体滴度。,病毒分离技术(四) 中和抗体测定,病毒滴定结果判断示意图,1001,病毒分离技术(四) 中和抗体测定,SpearsmanKarber公式: LogCCID50=Xm1/2dd(Pi/100) Xm=所用病毒最低稀释度(最高浓度)的对数 d=稀释度系数(倍数)的对数。 Pi=各稀释度出现CPE百分数的总和。,病毒分离技术(四) 中和抗体测定,病毒滴定结果的判定 Sabine: LogCCID50=0+0.5-1(100+100+100+25)/100=-2.75 Sabine: LogCCID50=0+0.5-1(100+75+25)/100=-1.50 Sabine: LogCCID50=0+0.5-1(100+100+50)/100=-2.00,病毒分离技术(四) 中和抗体测定,病毒滴定对照结果的判断 Sabine:取2.75的反对数,即得到攻击病毒的含量:562CCID50/0.025ml。 Sabine:取1.50的反对数,即得到攻击病毒的含量:31.6CCID50/0.025ml。 Sabine:取2.00的反对数,即得到攻击病毒的含量:100CCID50/0.025ml。,病毒分离技术(四) 中和抗体测定,简单的判定是否有效的方法: 32320 CCID50/0.025ml 的对数: 1.5052.505(1.52.5) 1.52.5的反对数: 31.62316.
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