蓝莓组织培养快速繁殖技术研究初报.pdf

上海农业科技 2 0 1 l 6 蓝莓组织培养快速繁殖技术研究初报 陆锦明 朱天华 王彩波( 上海市闵行 区苗圃 2 0 1 1 0 9 ) 汤桂钧蒋建平胡海峰( 上海市闵行区农业科学研究所2 0 1 1 0 9 ) 摘要：以适合南方地区栽培的 “ 南高丛”蓝莓当年萌发新枝为外植体 ，经过清洗消毒后，切成长 l c m 左 右的嫩茎段 ，接种于发生培养基上育出无菌 系。经试验 ，筛选 出适宜 发生 、增殖及生根的培养基配方 试管苗 生根率 达 96 ，炼 苗成 活率 高 达 9 8 ，种苗 生 长健 壮 。 关键词 ：蓝莓 ；组织培养 ；快速繁殖 蓝莓属于杜鹃花科越桔属常绿小灌木， 其栽培种类主要 有 “ 南高丛” 、“ 北高丛”及 “ 兔眼蓝莓”三大类。南方地区 包括长江中下游地区适合种植 “ 南高丛” 及 “ 兔眼蓝莓” 。由 于蓝莓具有极高的营养和保健价值， 其富含的花青素对人类 健康极为有利， 故被联合国粮农组织推荐为世界五大名贵保 健水果之一。近年蓝莓在上海及周边地区已有少量栽培 ， 种 苗繁育技术亦已展开。蓝莓繁育方法主要依靠扦插及组织培 养， 而应用组织培养技术快繁种苗具有脱病毒、 提纯复壮及 工厂化周年生产的优势， 因此， 笔者近年开展了组织培养方 面的试验研究， 并已取得初步成效 ， 现将研究结果报道如下。 1 材料与方法 I 1 无茵系的发生培养 参试品种为 “ 南高丛” 类型的主栽品种。选择健康母株 上当年萌发、 呈半木质化的枝条( 判断标准为叶色基本转绿、 枝条柔软有弹性) 。从植株上整枝剪下， 剪去叶片。将嫩枝用 洗涤剂清洗2 遍， 用纱布包裹后置自来水龙头下冲洗2 h。在 无菌室超净台上进行消毒处理：先用 7 5 酒精消毒 1 rai n ， 然后用 I ： 5 0 洁尔敏消毒 2 0 rai n ；最后用 0 1 生汞消毒 1 5 rai n， 最后用无菌水冲洗3 遍沥干备用。将消毒的嫩枝切成 1 c l n长的茎段， 每一茎段带 l 2 个节间 ( 腋芽) ， 接种于发生 培养基上。以MS 为基本培养基 ， 分别添加Z T( 玉米素) 、 BA ( 6 一苄氨基嘌呤) 、NAA( 萘乙酸) ， 配置了3 种发生培养基， 以期从中筛选出适宜的配方， 诱导嫩茎段中的隐芽萌发培育 成无菌系。接种后2 周内采取暗培养，以防止嫩茎段褐化死 亡。培养室温度2 3l，2 4 h恒温，茎段腋芽开始萌发 后每天光照 1 2 h， 光强 3 0 0 0 L x左右。 1 2 无菌系的继代增殖 在木本植物及部分草本植物的茎杆节间内均有隐芽( 即 腋芽) ， 这些腋芽在通常情况下不萌芽呈隐生状态， 且这些新 芽一般不带病毒或病菌， 故在组织培养中， 尤其木本植物的 组织培养中常以嫩茎段作发生培养的外植体 ， 以培养成无菌 系而实现继代增殖。以MS 为基本培养基， 分别添 I Z T、 B A、 K T、 N A A、 I B A等激素， 配置了6 种增殖培养基配方， 以期 从中筛选出适宜的配方及增殖率。每3 0 天增殖1 次， 培养室 收稿 日期 ：2 01 1 0 9 0 7 温度及光强与发生培养相同；每 l L培养基含琼脂 6 5 g、 糖 3 0 g，p H为 5 8 。 1 3 无菌系的生根培养及试管苗炼苗 以 1 2 MS + I B A0 5 mg L培养基为对照，筛选出3 种 培养基作生根培养试验。配置 l 2 MS时，每 1 L培养基含 糖 2 0 g，铁盐不减半，p H为 5 8 ，培养室温度、光照与继 代增殖相同。 2 结果与分析 2 1 嫩枝成熟度与发生培养成功率的关系 试验发现， 当年萌芽新枝的成熟度与发生培养成功与否 及发生率 ( 萌芽率)高低密切相关。若枝条太幼嫩， 因组织 结构稚嫩 ， 腋芽尚未发育成熟， 经过杀菌消毒及离体培养后， 会产生茎段褐化现象， 其主要原因是消毒剂的毒害作用及茎 段离体后体内多酚类复合有机物在多酚氧化酶的作用下氧化 使组织褐变死亡；若枝条过于老健，虽可减轻或避免褐化， 但腋芽萌发差， 通常不到1 0 或完全不萌芽。需强调的是， 前 2 周的暗培养至关重要， 可避免多酚复合物的产生。本试验结 果表明， 半木质化的新枝其发生效果最佳， 培养3 0 d时长度 可达 3 c m，且有分枝出现，形成丛生苗，无菌系培育成功。 2 2 培养基对发生培养和增殖培养的影响 研究发现， 发生培养的配方比较试验中， 以1 2 MS + Z T 3 mg + NAA0 2 mg L为好，发生成功率高达 8 1 ，其他 配方效果不太理想 ( 见表 1 ) 。 表 1 不 同培养基 发生 培养结果 玉米素 ( Z T)是迄今应用最广的 3 种细胞分裂素 ( Z T、 KT、 B A)中活性最大的一种 ，具有高效的诱导力，一般培 养 l 0多 d腋芽开始萌动，3 0 d时可长至 2 c m左右，4 5 d 后便在新芽基部长出分枝形成丛生芽， 初始无菌系建立。 初始无菌系诱导成功后， 将新芽从母体茎段上切下， 接 种至继代增殖培养基上进行增殖扩繁， 以培养丛生芽。在多 种培养基比较中， 以l 4 MS + Z T2 mg + C H5 0 0 mg L( C H 为水鲜乳蛋白) 及l 2 Ms +KT 0 5 mg L最好。这两种培养 一 73 上海农业科技 2 0 1 1 6 基的继代增值率在 l： 3 5 ，在培养3 0 d左右继代一次的情 况下， 幼苗叶色深绿， 叶面积均较大， 生长健壮， 无“ 玻璃苗” 发生， 为以后生根培养奠定了基础。在木本类植物组织培养 中，均存在增殖与壮苗的矛盾 ，在高增殖率下 ( 1： 5 以上) ， 势必在培养基中增加细胞分裂素及无机盐的浓度， 但随之会 导致丛生芽过多 、 分枝细弱 、 叶片黄化 ， 甚至产生 “ 玻璃苗” ， 以后转至生根培养时， 生根困难甚至完全不生根。本试验在继 代增值中使用了 l 2 Ms及 1 4 MS ，亦降低了细胞分裂素浓 度，同时不添加生长素，有效解决了壮苗与增殖的矛盾。 2 3 光照、 温度对发生培养和增殖培养的影响 光照 、 温度与幼苗生长亦 十分密切 ， 在发生 阶段 的初期 ， 很多木本植物及少数草本类植物均需要暗培养 ， 因多酚类物 质在强光下会氧化， 使外植体褐变死亡 。因此， 在初始培养 前2 周不加光即利用自然光 ， 实践证明是成功的， 但在嫩茎 段萌芽后便需加光，每天光照 1 2 h，光强 3 0 0 0 L x左右 ， 可促进幼苗正常生长， 否则会造成幼苗生长缓慢或叶绿素合 成差而形成“ 玻璃苗” 。温度亦是确保幼苗正常生长的重要因 子， 试验结果表明， 在2 3恒温条件下， 幼苗叶色浓绿， 生 长健壮 良好， 无论在发生培养阶段及增殖培养阶段， 这一温 度无疑是合适的，过高和过低均对发生培养和增殖培养不 利 。温度过低 ， 幼苗生 长缓慢 ， 达不 到快繁 的 目的；温度过 高，则会 “ 窜苗” ，幼苗又细又长，严重影响生根。 2 4 培养基对生根成苗的影响 木本植物较草本植物难生根， 且生根周期长， 这是组织 培养界的共识，而适宜的培养基是提高生根率的关键技术。 本试验中筛选出3 种培养基配方，效果良好 ( 见表2 ) 。 表 2 不同培养基 的生根情 况 S 2 、 S 及S 培养基的生根效果很优异，而作为对照的S 不太理想，单生根率而言，S 3 最好 ，高达9 6 ， 该结果在木 本植物中少见， 这主要是大幅度提高了NAA的浓度且添加 了活性炭的原因。活性炭在培养基中主要起通气和促进养分 吸收的作用 ， 间接促进了生根 ， 从生根率、 试管苗素质等综 合比较看 ，以S 表现最好 ， 这一培养基又称为 “ 瓶内通气式 微型扦插培养基” ， 其配方是 2 份泥炭+ 1 份珍珠岩+ 生根粉 +适量水，培养瓶灌装半瓶，经 l 2 1、1 1 MP a 高压灭 菌锅消毒灭菌3 O rai n， 冷却后无菌接种生根， 约经3 N培养 ， 根系完全长出且白根多， 根毛多， 幼苗健壮， 此方法不失为 很多木本植物 的优 良生 根配方。 2 5 试管 苗炼 苗 炼苗基质采用 “ 泥炭 +珍珠岩”配方 ，配比为2： 1 ， 充 分拌和后平铺于塑料大棚苗床上 ， 厚度 8 c m左右。将苗浅 栽至基质中， 浇足活棵水， 用塑料小环棚覆盖，防幼苗失水 萎蔫。第2 天开始每天叶面喷雾清水3 5 次， 7 d 后逐步揭 开小环棚通风炼苗， 如遇晴天高温则需要用7 5 遮光率的遮 阳网遮荫，保持大棚 内温度不超过 3 0 ，空气相对湿度 6 0 7 0 ， 以2 0 2 5最宜。2 N后根据苗情追施营养液， 用0 2 磷酸二氢钾+ 0 2 硝酸铵浇灌及叶面喷雾， 每 1 5 天 施肥1 次。经精心管理 ，获得了9 8 以上的高存活率，组培 苗生长健壮， 苗高达 6 8 c r f l ，根系发达，质量优异。 2 讨论与小结 蓝莓近年来得到广泛重视 ， 种植及综合开发应用方兴未 艾， 对种苗的需求也不断增长， 而应用组织培养技术快速繁 育种 苗是其捷径 ， 可有效解决 种苗奇缺的状况 。本研究初步 总结了蓝莓组织培养的整套关键技术， 具有创新意义。 本研究得出，外植体发生培养以半木质化的嫩茎段为 好， 具有发生早、 发生率高及无褐化的优点， 培养基配方以 “ 1 2 MS + Z T3 mg L + NAA0 2 mg L ” 较好。继代增殖 培 养基以 1 4 MS +Z T2 rag L +C H5 0 0 mg L较好 ， 可有效解 决壮苗与增殖之间的矛盾，防止 “ 玻璃苗”产生， 有利于以 后生根培养， 提高生根率及试管苗健壮。发生培养、 继代增 殖及生根的培养室温度均以2 3为宜， 光强3 0 0 0 L x， 每 天光 照 1 2 h。 生根培养及试管苗炼苗是整个组培技术的最后阶段， 亦 是组培成功与否的关键技术。生根培养基配方以“ 泥炭+珍 珠岩+生根粉+ 水” 为好， 培育出的幼苗健壮且生根率高， 根 系发达， 炼苗存活率高 ， 生长明显快于其他生根培养基配方 育出的幼苗。在炼苗阶段 ， 根据天气情况， 防高温伤苗及失 水萎蔫是主要技术措施，需将塑料大棚温度控制在 2 0 2 5 ，最高不超过 3 0，空气相对湿度6 0 7 0 ，每 l 5天 施营养液 1 次，可保证幼苗正常生长。 木枣 宰奉车 牛率车车 木木卑车车 车车水 牛水牛， # 枣 木车车 木水木宰 术车车 拳 术水车车 车木木 水术水牛 牛牛牛 牛牛丰丰 车半术车 车半车车 车车车 牛卡车车 牛牛车 牛车车 半羊 羊 羊 车车半 车牛车 半牛车 ￥ 车 眷羊 车半羊 丰年 羊半 羊 车 羊 ( 上接第8 1 页) 1 0 0 0 倍液喷雾防治 。( 3 )大豆病毒病。加强田间管理 ， 及 蚜虫。在蚜虫初发阶段， 用 1 O 蚍虫啉可湿性粉剂 3 0 0 0 倍 早防治蚜虫；发病初期可用 2 O 病毒A可湿性粉剂 5 o 0 倍 液防治。( 4 ) 小卷叶蛾。在发生初期用2 5 功夫菊酯2 0 0 0 液防治。 倍液喷雾防治，隔 7 d再防 1 次