DNA的生物合成.ppt

C,G,A,交替的磷酸基团和戊糖构成了DNA的骨架 (backbone)。,DNA链的方向是5 3,核苷酸的排列顺序是核酸的一级结构,5端,3端,书写方法：,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5 A C T G C T 3,3,1,5,DNA的二级结构是双螺旋结构,DNA双螺旋结构模型的要点:,1.DNA是反向平行、右手螺旋的双链结构,脱氧核糖和磷酸基团组成的亲水性骨架位于双螺旋结构的外侧，疏水的碱基位于内侧。,5,3,2.DNA双链之间形成了互补碱基对,(AT,GC),3.疏水作用力和氢键共同维系着DNA双螺旋结构的稳定。,横向：氢键维持稳定,纵向：碱基堆积力维持稳定,DNA复制时：,双链打开，以亲代DNA为模板，按碱基互补原则，合成子代DNA.,DNA的生物合成 DNA Biosynthesis，Replication,第十四章,复制(replication) 是以DNA为模板的DNA合成，是基因组的复制过程。在这个过程中，亲代DNA作为模板，按照碱基配对原则合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合反应。,本章主要内容：,DNA复制的基本特征 DNA复制的酶学和拓扑学变化 原核生物DNA复制过程 真核生物DNA生物合成过程 逆转录和其他复制方式,DNA复制的基本特征 Basic Rules of DNA Replication,第一节,半保留复制(semi-conservative replication) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication),DNA复制的主要特征,半保留复制(概念) 双向复制 (复制子） 半不连续复制,(前导链链、后随链、岡崎片段）, 知识要点：,子链继承母链遗传信息理论上几种可能的方式:,实验结果支持半保留复制的设想。,含重氮-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,重-DNA,重氮-DNA,杂合-DNA,杂合-DNA,普通-DNA,重-DNA,一、 DNA以半保留方式进行复制,密度梯度实验,DNA复制时，亲代DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致,这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念:,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G G T G A C C,A G G T A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,半保留复制的阐明，对了解DNA的功能和物种的延续性有重大的意义。,复制眼,二、DNA复制从起点向两个方向延伸,两个复制叉,复制起始点,原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin）。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始双向复制。,A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter),A B C,5,5,3,3,真核生物每个染色体多个起始点,是多复制子的复制。（多点双向复制）,(replicon),复制子,复制子：是含有一个复制起点的独立完成复制的功能单位。,*,后随链 (岡崎片段) (lagging strand),另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为后随链。复制中的不连续片段称为岡崎片段。,前导链连续复制而后随链不连续复制，就是复制的半不连续性。,*,*,三、DNA复制反应呈半不连续特征,DNA复制的酶学和 拓扑学变化 The Enzymology of DNA Replication,第二节,参与DNA复制的物质:,解开成单链的DNA母链,dATP, dGTP, dCTP, dTTP(dNTP),依赖DNA的DNA聚合酶 简写为 DNA-pol,*,*,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,RNA引物,RNA引物,子代DNA,复制的化学反应:,DNA链的方向只能 是5 3,必须要有引物,特点:,原料: dNTP,3，5磷酸二酯键,一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合,引物： 是互补于模板链的一个寡聚核苷酸片断。 特点： 1、带有一个游离的3-OH末端。 2、模板必须转变成单链。,*,3 5外切酶活性:,5 3外切酶活性:,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性:,（一）原核生物的有3种DNA聚合酶,(1) DNA-pol (2) DNA-pol (3) DNA-pol ,个核心酶 1个-复合物（、 6种亚基） 1对-亚基（可滑动的DNA夹子）,(1) DNA聚合酶全酶结构:,全酶结构包括：,(真正起催化作用的酶),(2) DNA-pol （109kD）,（不是主要复制酶）,小片段(33kD),5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段(76kD), 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,功能：1、对复制中的错误进行校读，,DNA-pol（单链多肽109KD）,2、对复制和修复中出现的空隙进行填补。,*,(工具酶), DNA聚合酶活性和校对活性,3 、除去DNA合成所需的引物。,*,(3) DNA-pol （120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。 DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。,原核生物DNA聚合酶,聚合速度(核苷数/酶分子 . 分钟) 600 30 约30 000 功 能 切除引物修复填补空缺 修复？ 复 制,单体,单体,多亚基复合物,*,*,DNA-pol ,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制 。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有5种,*,*,二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功能实现复制的保真性,复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。,此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。,遵守严格的碱基配对规律； 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 复制出错时有即时校对功能。,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：,（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择,利用“错配”实验发现，DNA pol 对核苷酸的参入（incorporation）具有选择功能。 DNA pol 对嘌呤的不同构型表现不同亲和力，因此实现其选择功能。,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现外切活性。,*,（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,*,三、复制中的解链伴有DNA 分子拓扑学变化,（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态,*,解螺旋酶(helicase)又称解链酶或rep蛋白 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。,引物酶(primase) 依赖DNA的RNA聚合酶 复制起始时催化生成RNA引物的酶 催化游离的NTP聚合，生成短链RNA， 引物的作用为：提供3 OH末端,单链DNA结合蛋白 (single stranded DNA binding protein, SSB),在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整性。,（二）DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态,复制过程正超螺旋的形成：,拓扑异构酶作用特点: 既能水解 、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类:,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制:,*,复制中理顺DNA链,目 录,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式:,四、DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,目 录,双链中的单链缺口,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。,功能:,*,DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成的比较,原核生物DNA复制过程 The Process of DNA Replication,第三节,分为三个阶段,起始 延伸 终止,起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成RNA引物。,需要解决两个问题：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。,一、复制的起始,E.coli复制起始点 oriC,（一） DNA的解链,识别区,解链区,原核生物的复制起始部位及解链,Dna A,Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,含有解螺旋酶(Dna B)、DnaC蛋白、引物酶(Dna G)和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,*,Dna B,(解螺旋酶),(Dna G),引发体,*,（二）引物合成和引发体形成,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,起始完成：,1. DNA解开成单链，提供模板。,2. 合成引物，提供3-OH末端。,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链的3-OH 上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,二、DNA链的延长,OH 3,3,目 录,前导链的合成,目 录,后随链的合成,目 录,5,解链方向,在复制叉同时合成前导链和后随链,复制过程简图,前导链,后随链,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,三、复制的终止,3、,35,53,后随链上不连续性片段的连接,*,*,*,真核生物DNA生物合成过程 The Process of DNA Replication,第四节,真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等； DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶/转换； 切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse H和FEN1等。,真核生物与原核生物DNA复制的差异：,*,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期(S期),G1,G2,S,M, 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,*,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。,一、真核生物复制的起始与原核基本相似,*,真核生物复制起始点比E.coli的ori C短。 酵母DNA复制起始点含11bp富含AT的核心序列：A（T）TTTATA（G）TTTA（T），称为自主复制序列（ARS，autonomous replication sequence)。 把ARS克隆至基因工程载体质粒上，可以启动其它外源基因的复制。,复制起始包括打开复制叉、形成引发 体和合成RNA引物,具体机制不详。,复制的起始需要DNA-pol （引物酶活性） 和pol （解螺旋酶活性）参与。还需拓扑 酶和复制因子(replication factor, RF)。,增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA ）在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E.coli DNA 聚合酶的亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合于引物模板链；并且PCNA使pol获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。,*,*,真核DNA复制主要蛋白质的功能,*,*,DNA-pol 和pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-pol 通过PCNA的协同作用，逐步取代pol ，在RNA引物的3-OH基础上连续合成前导链。后随链引物也由pol 催化合成。然后由PCNA协同，pol 置换pol ，继续合成DNA子链。,二、真核生物复制的延长发生DNA聚合酶/转换,前导链：出现在引发后期 后随链：发生于每个冈崎片段合成之际 发生DNA聚合酶/转换的原因是Pol 不具备持续合成能力。 DNA聚合酶/转换的关键蛋白是RFC。,DNA聚合酶/转换,*,3,5,5,3,前导链,3,5,3,5,亲代DNA,后随链,引物,核小体,三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体,四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题,5,5,3,3,(replicon),复制子,*,3 5,3 5,前导链产生完整的子染色单体。 后随链3端留下缩短的未复制的ssDNA区。,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,目 录,真核生物端粒的形成：,端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。,结构特点, 由末端DNA序列和蛋白质构成。 末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。,5,3,3,5,端粒酶(telomerase),端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。,端粒酶的分子结构,端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白1 (human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTRT),端粒酶的组成,端粒酶的催化延长作用,爬行模型,目 录,T,G,T,G,G,母链藉非标准碱基配对回折,DNA聚合酶,进一步加工,端粒及端粒酶的意义,成年人端粒比胚胎细胞端粒短； 老化与端粒酶活性下降有关； 肿瘤的发生与端粒酶活性有关； 端粒酶不一定能决定端粒的长度。,真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞周期的S期，而且只能复制一次。,五、真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能复制一次,逆转录和其他复制方式 Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways,第五节,本节主要内容：,1.逆转录概念、 cDNA的概念 2.逆转录酶催化的反应，（3个活性） 3.逆转录研究的意义。,逆转录 (reverse transcription) 在逆转录酶的催化下，以RNA为模板合成DNA的过程，又称反转录。,一、逆转录病毒的基因组是RNA， 以逆转录机制复制,逆转录酶 (reverse transcriptase),从逆转录病毒中发现，能催化以RNA为模板合成双链DNA的酶，全称为RNA依赖的DNA聚合酶。(RDDP),有三种活性：RNA指导的DNA聚合活性 RNase H活性 DNA指导的DNA聚合活性,含有逆转录酶的RNA病毒,称作逆转录病毒,一些逆转录病毒