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人乳中蛋白质的组成分析 石磊*刘晓梅程舸王韶 ( 吉林大学公共卫生学院长春 130021) 摘要在对人乳样品分离与纯化的基础上， 采用 “Bottom Up” 并结合高效液相色谱( HPLC) 和配有纳米喷雾 ( Nano- spray) 技术的高分辨傅里叶变换离子回旋共振质谱( FT- ICR- MS) ， 将人乳各部分蛋白质样品酶解成多 肽片段。利用碰撞活化解离( CAD) 和电子捕获解离( ECD) 2 种解离方式断裂机理的互补性规律， 借助 Mascot 软件数据库， 快速分析了人乳样品中乳脂部分、 乳清部分和乳粒部分所含主要蛋白质的组成。人乳样品各部 分的共同物性是均含有多种角蛋白、 乳白蛋白、 乳铁蛋白， 但含量和种类各有不同， 这既表明了人乳特殊的营 养成分， 又从另一角度显示出人乳各个部分营养价值的差异。 关键词人乳， 蛋白质， 组成 中图分类号: O655文献标识码: A 文章编号: 1000- 0518( 2010) 09- 1099- 06 DOI: 10 3724/SP J 1095 2010 90852 2009- 12- 18 收稿， 2010- 04- 04 修回 吉林省科技厅白求恩医学专项基金( 200705391) 通讯联系人: 石磊， 女， 博士， 副教授;E- mail: shilei jlu edu cn;研究方向: 药物化学 人乳蛋白分乳脂蛋白、 乳清蛋白和乳粒蛋白， 其中各部分所含蛋白各不相同， 乳清蛋白占 50% 60%以上， 不仅含有丰富的乳铁蛋白和溶菌酶1 ， 而且还含有多种与疾病的发生与病变相关的蛋白， 它 们的组成与含量不仅直接决定其营养价值， 其细微结构的变化还能提供某些疾病发生、 变化的相关信 息 2 。传统蛋白质的检测主要采用凝胶电泳、 等电聚焦、 凯氏定氮法、 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳( 2D- Gel) 、 亲和层析( Affinity Chromatography， AC) 及高效液相色谱分离( HPLC) 等方法 3- 4 。但此类方法程序 复杂， 成本高， 消耗时间长。具有高分辨率的傅里叶变换离子回旋共振质谱( FT- ICR- MS) ， 与肽库配合 应用， 已经成为生命科学相关领域不可缺少的工具之一5- 7 。FT- ICR- MS 独特的裂解技术， 电子捕获解 离( Electron Capture Dissociation， ECD) 不仅可以优先断裂 SS 和 NC键， 而且还可以进行蛋白质修 饰后定位 8- 10 。根据多肽碎片命名规则并结合碰撞活化解离( Collisional Activated Dissociation， CAD) CAD 和 ECD 这 2 种解离方式断裂机理的互补性规律， 先将蛋白质酶解成多肽再进行分析， 可以提供更 多蛋白片段的结构信息， 达到 100% 的覆盖率 11- 12 ， 从而提高对蛋白质酶解片段裂解机理鉴定的可信 度 13- 14 。本文采用“Bottom Up”并结合 HPLC 和配有 Nano- spray 技术的高分辨 FT- ICR- MS 等方法， 在 对人乳样品分离与纯化的基础上， 将各部分人乳蛋白酶解成多肽片段， 首次利用 CAD 和 ECD 这 2 种解 离方式断裂机理上的互补性规律， 借助 Mascot 软件数据库， 在多肽水平上快速分析并鉴定了人乳样品 中乳脂部分、 乳清部分和乳粒部分所含蛋白质的组成， 并对各部分的差异进行了对比分析。 1实验部分 1 1试剂和仪器 胰蛋白酶， 柠檬酸， 柠檬酸铵， 尿素， DDT， TFA， 碘化乙酰胺， 乙氰( 美国 Sigma 公司) ， 丙烯酰胺， Tris- HCl， 溴酚兰， 考马斯亮兰( 中国华美公司) 。其它试剂均为分析纯试剂， 实验用水为二次蒸馏水。Waters 2695 型高压液相色谱( 美国 Waters 公司) ， 7 0 T 型傅里叶变换离子回旋共振质谱仪( FT- ICR- MS) ( Finnigan LTQ FT， 德国 Thermo Bremen 公司) ， CS380 型高速离心机( 美国 Alfa Wassermann 公司) 。 1 2人乳样品的分离 人乳样品在 20 冰箱中保存， 实验前取出在室温放置 2 h 后， 置于低温高速离心机中离心 第 27 卷 第 9 期应 用 化 学Vol 27 No 9 2010 年 9 月 CHINESE JOURNAL OF APPLIED CHEMISTRYSep 2010 45 min， 转速为 14000 r/min， 温度控制在不超过 0 。离心处理后， 进行初步的分离， 得到乳脂、 乳清和 乳粒部分， 其中乳脂部分在上层， 乳清部分在中层， 乳粒部分在底部，置于 20 冰箱中冻存24 h后， 将 各部分分开收集。人乳样品的分离流程参见图 1。 图 1人乳样品的分离示意图 Fig 1Separation and purification scheme of human milk 1 3乳脂和乳粒蛋白样品的电泳分析 通过不同量乳脂部分蛋白电泳分析效果， 确定最佳样品量， 分别将乳脂部分和乳粒部分进行 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。 1 4乳清蛋白样品的色谱分析 乳清部分用 1 mol/L 硫酸调节至 pH =4. 6， 沉淀， 离心后用微显进样器吸去上层乳清蛋白， 除去下 层酪蛋白， 沉淀后， 采用高效液相色谱配有 SCX 色谱柱进行分离， 流动相 A 为 20 mmol/L 柠檬酸、 20 mmol/L柠檬酸铵、 pH = 3. 0; 流动相 B为 20 mmol/L 柠檬酸、 20 mmol/L 柠檬酸铵、 0. 5 mol/L NaCl、 pH =3. 0， 进行梯度洗脱， 先由 100% 流动相 A 洗脱 20 min， 然后由流动相 B 体积分数从 0 10% 洗脱 10 min后， 再大幅度增加流动相 B 体积分数从60% 100% 洗脱 10 min， 在洗脱的过程中保持总流速为 1 mL/min， 柱温为 35 。 1 5蛋白质样品酶解 乳脂部分、 乳清部分和乳粒部分的蛋白质样品各 5 g 与90 L 0. 1 mol/L NH4HCO3、 20 L 6 mol/L 尿素、 4 L 100 mmol/L DDT 在56 共同培养1 h， 冷却至室温使其变性与降解。加入4 L 500 mmol/L 碘化乙酰胺于室温孵育 30 min 进行烷化反应。加入 100 L 0. 1 mol/L NH4HCO3同时加入胰蛋白酶， 于 37 孵育16 h 消化降解。加入4 L 纯乙酸和81 L 体积分数为0. 1%的乙酸， 进行淬火反应使反应终 止， 蛋白样品即被酶解为多肽片段。 1 6质谱测定 经胰蛋白酶酶解后的多肽样品置于 96 孔板自动进样系统中， 利用配有 Nano- spray 技术( 15 cm 长 的 Proxeon nano- ESI 发射器， 填充物为直径 3 m 的 C18 树脂) 的高分辨 FT- ICR- MS， 利用配有 Nano- spray 技术的高分辨傅里叶变换离子回旋共振质谱仪， 测定样品的质谱图。流动相 A 为体积分数 99. 5% 水和 0. 5%乙酸， B 为 90%乙氰和 9. 5%水及 0. 5% 乙酸， 流速为 500 nL/min， 梯度洗脱。FT- ICR- MS 金 属毛细管电压 2. 5 kV， 毛细管温度 110 ， 锥孔电压 30 V， 碰撞激发电压 2. 7 3. 2 V， 碰撞气体为高 纯 N2气， 脉冲时间 250 ms。 0011 应 用 化 学第 27 卷 2结果与讨论 2 1电泳分析 通过不同量( 1. 6 40. 0 g) 乳脂部分蛋白 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析效果( 图 2) ， 确定乳脂部 分和乳粒部分最佳样品上样量为 20. 0 g。 图 2不同量乳脂部分蛋白样品电泳分析图 Fig 2SDS PAGE of the fat Part in human milk M Marker;a40 g;b200 g;c 10 0 g; d 50 g;e 1. 6 g 图 3乳脂与乳粒部分蛋白样品电泳分析图 Fig 3SDS PAGE of proteins in the fat and pellet parts of human milk( 20 0 g) a fat part;b pellet part 图 4乳清部分 SCX 色谱柱的 HPLC 分离与纯化色谱图 Fig 4HPLC of SCX chromatogram of proteins in the whey part of human milk 再分别选取乳脂部分、 乳粒部分蛋白样品各 20. 0 g 进行 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析， 结果 如图 3 所示。 2 2HPLC 色谱分析 将乳清部分蛋白样品用 1 mol/L H2SO4( pH = 4. 6) 沉淀除去酪蛋白后， 通过 SCX 色谱柱进行 HPLC 分离， 得到 10 个组分， 结果如图 4 所示。 2 3蛋白质组成分析 将乳脂部分、 乳清部分和乳粒部分分离后的各 蛋白组分， 用胰蛋白酶在温和条件下进行酶解。利 用 FT- ICR- MS 串联质谱( MS/MS 或 MSn) ， 母离子的 活化采取 CAD 和 ECD 的方式( 图 5) ， 得到若干多 肽离子碎片的结构信息。 1011 第 9 期石磊等: 人乳中蛋白质的组成分析 图 5多肽碎片 CAD 与 ECD 裂解互补关系示意图 Fig 5Complementary relationship between CAD and ECD of polypeptide fragmentation 按照多肽碎片命名规则， 根据 CAD 的 CN 肽键断裂和 ECD 的 NC 断裂在裂解机理上的互补 性规律， 借助先进的 Mascot 软件数据库将所获得的质谱图进行分析、 对比， 获得了相关多肽片段的质谱 结构信息， 依据各个蛋白相对分子质量( Mr) 及相应分值( Score) ， 依次分析并鉴定了人乳样品中乳脂蛋 白、 乳清蛋白、 乳粒蛋白中蛋白质的组成， 分别如表 1、 表 2、 表 3 所示。 表 1乳脂部分蛋白组成分析 Table 1Composition analysis of proteins in the fat part of human milk Protein nameMrScore Xanthine dehydrogenase/oxidase1484803948 Lactotransferrin precursor801704813 Fatty acid synthase2758772492 ALB protein738812443 Butyrophilin subfamily 1 member A1 precursor595232525 Adipophilin482742693 Keratin，type II cytoskeletal 1660181778 Lactadherin precursor438941758 Polymeric- immunoglobulin receptor precursor844591410 Apolipoprotein A- I precursor307591484 Clusterin precursor530311160 Protein disulfide- isomerase precursor574801142 78 kDa glucose- regulated protein precursor724021015 Cargo selection protein TIP47471751185 Keratin，type I cytoskeletal 10597111004 Actin，cytoplasmic 142052969 Fatty acid- binding protein，heart147751054 Ras- related protein Rab- 1823248959 Lysozyme C precursor16982924 Alpha- lactalbumin precursor16670846 表 2乳清部分蛋白组成分析 Table 2Composition analysis of proteins in the whey part of human milk Protein nameMrScore Keratin，type II cytoskeletal 1660182318 Lactotransferrin precursor801701085 Keratin，type I cytoskeletal 9623201230 Keratin，type I cytoskeletal 1059711984 Keratin 2a65678734 Keratin，type II cytoskeletal 6E60142598 Keratin，type I cytoskeletal 1451744604 Alpha- lactalbumin precursor16670427 ALB protein73881425 Serotransferrin precursor79280383 Beta- casein precursor25423382 Keratin，type II cuticular Hb156875195 2011 应 用 化 学第 27 卷 续表 2 Protein name Mr Score Secreted phosphoprotein 133994278 Polymeric- immunoglobulin receptor precursor84459221 Splice Isoform 2 of Alpha- s1- casein precursor21758232 MGC27165 protein55203178 Keratin，type II cytoskeletal 562637136 Keratin，type I cytoskeletal 1651447190 Keratin，type I cuticular Ha3- II47325153 Kappa- casein precursor2035090 表 3乳粒部分蛋白组成分析 Table 3Composition analysis of proteins in the pellet part of human milk Protein name Mr Score Fatty acid synthase2758772318 Lactotransferrin precursor801701085 ALB protein738811230 Xanthine dehydrogenase/oxidase148480984 Butyrophilin subfamily 1 member A1 precursor59523734 Keratin，type II cytoskeletal 166018598 Apolipoprotein E precursor36246604 Actin，cytoplasmic 142052427 Carboxyl ester lipase79959425 Polymeric- immunoglobulin receptor precursor84459383 Protein disulfide- isomerase precursor57480382 Lactadherin precursor43894195 Clusterin precursor53031278 Lysozyme C precursor16982221 Fatty acid- binding protein14775232 Annexin A238677178 Splice Isoform 2 of Alpha- s1- casein precursor21758136 Keratin，type I cytoskeletal 1059711190 Complement C4- A precursor194247153 Eukaryotic translation elongation factor 1 alpha- like 35049590 人乳中乳清蛋白占 50% 60%以上， 在乳清部分蛋白中， 含量最多的是各种角蛋白( Keratin) ， 此外 还分析鉴定出骨桥蛋白( Secreted phosphoprotein 1， OPN) 15 ， 该蛋白是一种含精氨酸- 甘氨酸- 天冬氨酸 ( Arg- Gly- Asp， RGD) 带负电荷的糖基化的分泌型功能细胞外基质蛋白， 在介导细胞的趋化、 黏附、 增殖 和迁移， 以及骨组织的矿化与重建、 免疫调节、 信号传导等方面起着重要作用， 其细微糖基化、 磷酸化结 构的改变将导致不同疾病的发生及乳腺癌等肿瘤的转移16- 17 。 在人乳样品中， 乳脂部分、 乳清部分和乳粒部分所含蛋白质各有不同， 但均含有多种角蛋白 ( Keratin) 、 乳白蛋白( ALB protein) 及乳铁蛋白( Lactotransferrin) ， 但它们的含量和种类各有不同， 这既表 明了人乳特殊的营养成分， 又从另一角度显示出人乳各个部分营养价值的差异。 3结论 在蛋白质与多肽的质谱分析中， 质谱的准确性对测定结果有很大影响。FT- ICR- MS 以高分辨率、 高 质量检测上限、 高扫描速度、 宽的动态范围、 最佳的质量准确度等技术优势， 广泛地应用到蛋白质的研究 中， 成为将各种蛋白质与序列数据库联系起来的桥梁。电喷雾离子化技术( Electrospray Ionization， ESI) 的引入， 使 FT- ICR- MS 开启了高精度生物学分析的大门。本研究采用“Bottom Up” 并结合 HPLC 等方 法， 利用 FT- ICR- MS 串联质谱及 Nanoelectrospray 技术， 提高了 ESI 的灵敏度， 降低了对人乳样品纯度和 3011 第 9 期石磊等: 人乳中蛋白质的组成分析 检测量的限制。根据 CAD 的CN肽键断裂和 ECD 的 NC 断裂裂解机理的互补性规律， 借助先进的 Mascot 软件数据库进行质谱分析， 快速分析并鉴定了人乳样品中乳脂部分、 乳清部分和乳粒部分蛋白质 的组成， 为对人乳中蛋白质种类、 含量以及与人乳腺癌相关蛋白的进一步研究提供了理论参考。 参考文献 1ZHANG Yan- Chun( 张岩春) ， YOU Juan( 尤娟) ， LUO Yong- Kang( 罗永康) Dairy Ind( 乳品加工) J ， 2008， 9: 50 2Kjeldsen F， Savitski M M， Nielsen M L Analyst J ， 2007， 132: 768 3Sorensen S， 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