高效液相色谱法简介.ppt

1,化学化工学院,2,液相色谱分析是在经典的液体柱色谱基础上，引入了气相色谱的理论；在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化，这种柱色谱技术被称做高效液相色谱法。,高效液相色谱分析概述,3,4,叶绿素的柱色谱,5,三组分混合物的分离,6,在C18柱中，三组分混合物流出色谱柱的顺序为：萘，联二苯、蒽。,当试样混合物进入色谱柱后，就在固定相和流动相之间不断地进行分配平衡。不同的化合物，分子结构不同，存在理化性质的差异，所以在两相中存在的浓度也各不相同。固定相中存在量多的化合物，冲洗出柱子的时间就长，反之则短。这与分配系数有关： K = 化合物在固定相中的浓度C固 化合物在流动相中的浓度C流 K值小，先流出柱子，K值大的，保留作用强，后流出柱子。,7,8,键合相-反相色谱,9,1. 概 述,色谱法：(chromatography)： 以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法称色谱法。,几个概念 色谱柱：进行色谱分离用的细长管。 固定相：管内保持固定、起分离作用的填充物。 流动相：流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。,10,1-4 高效液相色谱法的特点,一 高压 液相色谱以液体作为流动相（称为载液），液体流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。在现代液体色谱中供液压力和进样压力都很高，一般可达到150300kgcm2，甚至可达700kcm2以上。,11,二 高速 高效液相色谱所需的分析时间较之经典液体色谱快得多，一般可达l10mLmin， 个别可高达100mLmin以上，这已近似于气相色谱的流速。,三 高效 气相色谱的分离效能很高，高效液相色谱的柱效则更高，一般约可达 60000理论塔板米；,12,四 高灵敏度 紫外检测器的最小检测量可达毫微克数量级(10-9 g)；荧光检测器的灵敏度可达10-11g。高效液相色谱的高灵敏度还表现在所需试样很少；微升数量级的样品就足以进行全分析。,13,1-5 高效液相色谱流程和设备,高效液相色谱仪一般可分为5个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下： 首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。,14,15,样品吸收度测定吸收池示图,16,紫外检测器工作原理,17,18,进样阀,样品,装样,废液,淋洗液,至分离柱,定量环进样,（）,（）,样品环,19,液相色谱动画演示,20,二、色谱图（chromatogram）,试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号，由记录仪所记录下的信号时间曲线或信号流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，或色谱图。如图12-2,常用术语：,1. 基线 : 在操作条件下，仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线。,21,2. 色谱峰: 当组分随流动相进入检测器时，其响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线。正常的色谱峰呈正态分布。,3.峰高与峰面积 峰高：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高(peak height)。用h表示。 峰面积：峰与峰底之间的面积称为峰面积(peak area)，用A表示。,22,21 保 留 值,一、保留时间（tR） 从进样开始到柱后出现样品的浓度极大值所需的时间为保留时间，用tR表示。,23,2-2 色谱柱的分离效率及柱效能的评价,一、塔板理论,塔板理论认为，一根柱子可以分为n段，在每段内组分在两相间很快达到平衡，把每一段称为一块理论塔板。设柱长为L，理论塔板高度为H，则 H=L/n 式中n为理论塔板数。,24,色谱柱的分离效率（简称柱效），可定量地用理论塔板数N来表示。,理论塔板数一N还与柱长有关，当比较两不同长度的色谱柱的柱效时，应当比较它们在相同柱长下的V值。,理论塔板数N,25,可用半峰高处的峰宽(半峰宽）和保留时间的关系来表示理论塔板数N，这时关系式为： N554 ( tR / Wt1/2 ) 2 2 式中： Wt1/2 -半峰宽,例如，从图2-3，测得tR=105mm、 Wt1/2 =4mm，求得N=3789，若此柱长为250mm,折成每米的理论塔板数约为15200.,26,2-3 分离度及影响因素,一 分离度（分辨率) 研究色谱中有关分离问题时，首先就是要能定量地确定相邻两峰的分离程度。,从图8-3可以看出，为了获得较好的分离，就必须使最大峰值之间的距离增加，峰宽减小。,27,28,一般用Rs来定量表达相邻两峰的分离程度，所以Rs是色谱中两个组分分离好坏程度的标志。要求RS1.5,tR1 tR2 Rs = 1/2(W1+W2),式中 tR1、tR2 分别为两组分的保留时间， W1 、W2为色谱峰的峰底宽度 .,29,5 高效液相色谱的定性和定量分析,5-1 定性分析,在液相色谱中保留值定性的方法主要是用直接与已知标准物对照的方法。当未知峰的保留值（t R或V R ）与某一已知标准物完全相同时，则未知峰可能与此已知标准物是同一物质，特别是在改变色谱柱或改变洗脱液的组成时，未知峰的保留值与已知标准物的保留值仍能完全相同，则可以基本上认定未知峰与标准物是同一物质。,30,5-2 定量分析,HPLC色谱定量的基本方法有内标法、外标法等。,外标法标准曲线法 是一种简便、快速的绝对定量方法（归一化法则是相对定量方法）。首先用欲测组分的标准样品绘制标准工作曲线。,31,具体作法是： 用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与欲测组分相同的色谱条件下，等体积准确量进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线，此标准工作曲线应是通过原点的直线。若标准工作曲线不通过原点，说明测定方法存在系统误差。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。,32,目前已普及于几乎所有重要的分析学科领域和许多科研生产部门，高效液相色谱能较理想地分离和分析与生物医学有关的大分子和离子型物质，易变质的天然产物，各种高分子化合物和不稳定化合物。,例如：蛋白质、核酸、氨基酸、多糖、颜料极性类脂肪化合物、药物、染料、表面活性剂、农药、甾族化合物、多环芳烃、合成聚合物、瞟