麸曲酱香酒醅中酵母菌的分离、筛选及应用.pdf

研究报告 中国酿造 2 0 0 8 年第1 期 总第1 7 8 期1 7 麸曲酱香酒醅中酵母菌的分离、筛选及应用 马荣山，刘婷，郭威 ( 沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳1 1 0 1 6 1 ) 摘要：以麸曲酱香型自洒洒醅为菌种来源，通过平板分离纯化得到7 株酵母菌。将各菌株分别制曲后测定酶活力及发酵力，筛选 出5 株酶活力高、发酵力强的酵母菌，并通过正交试验确定酱香酒的最佳工艺条件。结果表明，在发酵时间为2 l d ，发酵温度为2 0 ，曲 料比为l ：I 1 ，接种量为1 3 的条件下。酒的酱香味突出，酒质最好。 关键词：麸曲：酱香；酵母菌；筛选 中图分类号：T S 2 6 2 3 ；T S 2 6 1 1文献标识码：A文章编号：0 2 5 4 5 0 7 1 ( 2 0 0 8 ) 0 1 一0 0 仃0 2 I s o l a t i o n , s c r e e n i n ga n da p p l i c a t i o no f y e a s t sf r o mf e r m e n t e db r a n - k o j io f M a o t a i 。f l a v o rf i q u o r M AR o n g s h a n ，L I UT i n g ，G U OW e i ( C o l l e g eo f F o o d , S h e n y a n gA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y , S h e n y a n gI1 0 1 6 1 ，C h i n a ) A b 猷瑚| c t ：U s i n gf e r m e n t e db r a nk o j io fM a o t a i - f l a v o rl i q u o ra sm i c r o b i a ls o u r c e ，s e v e ny e a s t sw e r ei s o l a t e db ys t r e a kp l a t em e t h o d T h ee n z y m e a c t i v i t ya n df e r m e n t a t i o nc a p a c i t yw e r ee x a m i n e df o re a c hs t r a i nb yk o j i m a k i n g ，b yw h i c hf i v ee x c e l l e n ts t r a i n sw i t hh i g ha c t i v i t yw e r es c r e e n e d T h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rM a o t a i - f l a v o rl i q u o rp r o d u c t i o nw a sd e t e r m i n e db yo r t h o g o n a lt e s t T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg o o dl i q u o rw i t ht y p i c a l f l a v o ra n dh i g hq u a l i t yc o u l db ep r o d u c e da t2 0 “ Cf o r2 1dw i t h1 3 i n o c u l u mw h e nt h ea d d i t i o nr a t i oo f k o j ia n dm a t e r i a lW a s1 ：1 1 K e yw o r d s ：b r a n - k o j i ；M a o t a i f l a v o r ；y e a s t ；s c r e e n i n g 以茅台为代表的酱香型白酒，是我国五大主要香型白定菌落总数；常压干燥法测定水分；酸碱滴定法测定酸度； 酒之一。其酒质具有酱香突出、幽雅细腻、酒体醇厚、回味碘量法测定液化酶活力；D N S 法测定糖化酶活力；福林酚 悠长、空杯留香持久的风格特点，深受人民群众的喜爱f f l 。 法测定蛋白酶活力；C O ：失重法测定发酵力【“7 】。 该香型白酒为混合菌种发酵，其风格的形成与发酵过程中1 2 5 麸曲酱香酒发酵工艺流程【1 0 1 各种酵母菌的生命活动息息相关嘲。本实验对麸曲酱香酒 高粱，J 、麦- + 粉碎。润料。蒸煮糊化- + 摊凉- + 发酵- + 蒸馏_ 成品 醅中的酵母菌进行了分离纯化，并将各菌株分别制成酵母 矗酵毒曲 曲，通过对酵母曲各指标的测定筛选出最佳菌株；同时应 用自制麸曲酿造酱香白酒并确定最佳工艺条件，对提高和1 2 6 气相色谱条佳 稳定白酒的质量及产量具有重要意义。 F I D 检测器，色谱柱为C p S i l 毛细管色谱柱，柱长 1 材料与方法 3 0 m ，内径0 3 2 m m ，液膜厚度0 2 5 1 x m ，载气N z ，载气流量 料抖l m L m i n ，H 2 流量3 0 m L m i n ，空气流量3 0 0 m L m i n ，进样口 菌种来源：麸曲酱香型白酒酒醅( 由风城老窖酒厂提 温度2 0 0 ，检测器温度3 0 0 ，分流比3 7 ：1 ，起始柱温6 0 ， 供) ；培养基：麦芽汁培养基。原辅料：高粱、麸皮、稻壳。 恒温3 m i n ，以3 5 m i n 程序升温至1 8 0 。C ，继续恒温1 0 m i I l 。 1 2 实验方法 2 结果与分析 1 2 1 酵母菌分离 2 I 酒醅中酵母菌的分离、纯化 稀释涂布平板法和平板划线分离法f 2 4 一。 从麸曲酱香型白酒酒醅中经反复分离纯化出7 株酵 1 2 2 酵母菌纯化 母菌，其主要形态特征见表l 。 在麦芽汁琼脂培养基上选取形态不同的菌落，进一步 2 2 各酵母曲理化指标的比较 进行划线分离纯化，并用显微镜检查纯化效果。如不纯，再 将通过对麸曲酱香酒醅中分离纯化得到的7 株酵 挑单菌落进行划线培养，直至菌株完全纯化。 母菌分别制曲，编号为I ，并测定各理化指标，结果 1 2 3 菌种保存 见表2 。 将分离得到的酵母菌编号，并划线于麦芽汁斜面培养 由表2 可知，各曲的水分含量均为1 0 - 1 3 ，这样既保 基上低温保存。 一 证了菌的生长和酶的生成，又避免了因水分含量过多而造 1 2 4 酵母曲理化指标的测定 成雨季生霉。各曲的酵母菌数量较多，能在酿酒过程中起到发 将分离得到的菌株分别制曲后，采用血球计数板法测 酵作用。但不同酵母曲的化学指标有显著差异，其中酸度在 收稿日期：2 0 0 7 - 0 7 - l l 作者简介：马荣山( 1 9 6 1 ) ，男，辽宁锦州人，副教授，主要从事食品发酵、生物技术、白酒、饮料及食品添加剂的研究工作。 万方数据 18 2 0 0 8N o 1 S e r i a lN o 1 7 8 C h i n aB r e w i n g R e s e a r c hR e p o r t 0 9 m m o l 1 0 0 9 - 1 3 m m o V l O O g 的为级曲，在0 6 n m a o V l 0 0 9 一 0 9 m m o V l 0 0 9 的为二级曲【司，因此各曲酸度均满足理化要 求；液化力号偏低，其余均超过0 7 5 m g 淀粉( g h ) ：糖 化力号偏低，其余均一 2 5 0 m g 葡萄数( g 1 1 ) ；蛋白酶活 力号偏低，其余均 4 0 0 U g ；发酵力号和号偏低。综 合考虑各指标，选择I 、V 、号这几株菌作为酱香 酒曲的发酵菌种。 表17 株酵母菌的主要形态 T a b l e1 T h em a i nc o n f o r m a t i o no f7y e a s t s 表2 酵母曲发酵能力的比较 T a b l e2 T h ec o m p a r i s o no fv a r i o u sp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l i n d e xo fy e a s t - k o j i 水分菌落酸度液化力糖化力蛋白酶发酵力 曲号含量总数( m m o l 【m g 淀粉【m 薛髓潞活力【g C 0 2 ( g 堑! 全：g ：! ! ! ! ! 曼：! 竖：堕! 鱼：堕! ! ! 望：要! ! ! 墅： I 1 0 54 2 x 1 0 91 00 7 82 6 7 6 8 20 6 1 9 I I1 0 63 2 x 1 0 9 0 9 0 7 82 5 l6 5 00 4 6 1 I I I1 3 O2 O x l 0 9O 80 7 82 5 34 1 50 5 6 0 1 1 92 6 x l 矿0 70 7 5 2 7 62 8 80 3 3 2 Vl O 12 6 x 1 0 90 80 7 52 8 54 7 60 5 7 9 1 1 03 7 x 1 0 90 90 8 32 6 35 0 10 5 8 3 1 2 12 9 x 1 0 9 1 10 6 8 1 8 64 9 60 3 3 3 l ( 1 5 ) 1 ( 1 5 ) l ( 1 5 ) 2 ( 2 0 ) 2 ( 2 0 ) 2 ( 2 0 ) 3 ( 2 5 ) 3 ( 2 5 ) 3 ( 2 5 ) 2 0 2 6 2 1 5 8 2 0 4 3 6 7 5 7 1 9 6 8 1 4 4 l ( 1 2 ) 2 ( 2 1 ) 3 ( 2 8 ) l ( 1 2 ) 2 ( 2 1 ) 3 ( 2 8 ) l ( 1 2 ) 2 ( 2 1 ) 3 ( 2 8 ) 2 0 6 4 2 3 2 3 1 8 4 0 6 8 8 7 7 4 6 1 3 1 6 1 l ( 1 ：1 1 ) 2 ( 1 ：1 5 ) 3 ( 1 ：2 ) 2 ( 1 ：1 5 ) 3 ( 1 ：2 ) l ( 1 ：1 1 ) 3 ( 1 ：2 ) 1 ( 1 ：1 1 ) 2 ( 1 ：1 5 ) 2 0 6 8 2 l O 4 2 0 5 5 6 8 9 7 0 1 6 8 5 1 6 l ( 1 5 ) 、 6 7 4 2 ( 1 3 )7 8 0 3 ( 1 1 )5 7 2 3 ( 1 1 ) 7 0 7 l ( 1 5 )8 0 0 2 ( 1 3 )6 5 1 2 ( 1 3 ) 6 8 3 3 ( 1 1 )7 4 3 l ( 1 5 )6 1 7 2 0 9 1 2 11 4 = 6 2 2 7 2 0 2 2 6 7 9 7 0 5 6 7 4 3 1 2 3 麸曲酱香白酒酿造工艺的确定 以A 发酵温度( ) 、B 发酵时间( d ) 、C 曲料比以及D 接种量( ) 为因素，选取适当的水平进行麸曲酱香酒的发 酵试验，并分别对各酒样进行了感官评定和指标测定，结 果见表3 。 感官评定得分最高的工艺条件为A 2 8 2 C 2 D ：，即：发酵 时间为2 1 d ，发酵温度为2 0 ，曲料比为1 ：1 5 ，接种量为 1 3 。由此工艺酿造的酱香酒清亮透明，酱香突出，绵甜醇 厚，具有明显的酱香风格。 2 4 最佳工艺条件下酱香酒的微量成分分析 7 5 6 5 5 5 4 5 3 5 2 5 1 5 5 5 O2468 时间m i n 1 乙醛；2 乙酸乙酯：3 正丙醇；4 仲J 醇；5 乙缩醛；6 异丁醇；7 正丁醇； 8 丁酸乙酯；9 异戊醇；1 0 乳酸乙酯；l l - 棕榈酸乙酯；1 2 己酸乙酯；( 以下同) 图1 混合标准溶液的色谱图 F i g u r e1 C h r o m a t o g r a mo fm i x e ds t a n d a r ds o l u t i o n 3 0 ，2 5 2 0 毫1 5 l O 5 0 5 O2468l O1 2 时间m i n 图2 酱香酒样品色谱图 F i g u r e2 C h r o m a t o g r a mo fm a o t a i - f l a v o rl i q u o r 表4 酱香酒样微量成分色谱分析结果 T a b l e4 T h ec h e o m a t o g r a p ha n a l y t i cr e s u l t o fm i c r o - i n g r e d i e n ti n m a o t a i - f l a v o rl i q u o r 3 结论 3 1 从麸曲酱香型白酒酒醅中分离出7 株酵母菌，并分别 ( 下转第2 5 页) 2 3 4 5 6 7 8 9 硒磁k k b b R 万方数据 研究报告 中国酿造 2 0 0 8 年第1 期 总第1 7 8 期 2 5 浓度越高阻止钙沉淀的能力越强。通过观察0 6 9 L 的C P P s 能在7 0 m i n f 勾不生成钙沉淀；0 2 9 L 能阻止约2 0 m i n ，2 0 m i n 后沉淀逐渐产生；0 1 9 L 的C P P s 能阻止约7 m i n ，之后产 生沉淀。 一 昌 释 垃 珀 疑 鏊 g 耀 舞 时间m i n 图3 不同浓度C P P s l l l 阻止钙沉淀的结果 F i g u r e3 P r e v e n t i o no fc a l c i u md e p o s i t i o nb yd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s o f C P P s 固定化酶的生产试验积蓄了一定的技术基础。 参考文献： 【l 】P E T E R s o NRF ，N A U M A NLW ，M C M E E K 烈TL - 1 1 1 es e p ar a t i o n a n d a m i n oa c i dc o m p o s i t i o no fa p u r ep h o s p h o p e p t o n ep r e p a r e df r o m - c a s i n b yt h ea c t i o no f t r y p s i n 【_ 1 JA m e rC h e mS o c ，1 9 5 8 ( 8 0 ) ：9 5 - 9 9 【2 】削叫心悠0 NNJ ，I 也Y N O L D SEC C h a r a c t e r i z a t i o no fn y p t i cc a s e i n p h o s p h o p e p t i d e sp r e p a r e du n d e ri n d u s t r i a l l yr e l e v a n tc o n d i t i o n 【J 】B i o t e c hB i o a n g ，1 9 9 5 ( 4 5 ) ：1 9 6 - 2 0 4 3 】O N O T , O H O A W A T , T A K A G l Y C o m p l e x e s o f e a s e i n p h o s p h o p e p t i d e s a n d c a l c i u mp h o s p h a t ep r e p a r e df r o mc a s e i nm i c e l l e sb yt r y p t i cd i g e s t i o n 田 B i o s c i B i o t e c h B i o e h e m , 1 9 9 4 , 5 8 ( 劝：1 3 7 6 - 1 3 8 0 【4 】马翠娥，郑昌学，徐亦农高活力胰酶制备工艺的研究明中国生化药 物杂志，1 9 9 3 ( 3 ) ：1 1 1 3 【5 】罗虹，周昕工业胰酶生产工艺的研究叨中国生化药物杂志， 1 9 9 4 ( 1 5 ) ：2 8 3 2 8 4 6 】6 相沂孝亮酶应用手册( 黄文涛，胡学智译) M 】上海：科学技术出版 社，1 9 8 9 ：1 1 2 分别使用相同浓度( 0 6 9 L ) 的c P P s I ( 液态酶制备的 【7 1 譬竺掌居乃琥，陈石根固定化酶理论与应用【嗍北京：中国轻工业 产物) 和c P P s I I I ( 固定化酶制备的产物) 进行阻止钙沉淀 【8 】兰粪芸：茹主：天慧，等基础生化实验【M 】| t 京：高等教育出版 的测试，结果相似。 补1 0 R ， 3 结论 【9 】B E R R O C A LKe ta 1 T e c h n i c a la s p e c t so fp h o s p h o r u sr e d u c t i o na n d 以海藻酸钠制备固定化胰酶，优化了反应条件，测定 m i n e r a la d a p t a t i o ni ni n f a n tf o r m u l a e M o n a t s s e h rK i n d e r h e i l k d , 1 9 9 2 ， 了其特性。并对固定化胰酶水解产生C P P s 进行了相关分 1 4 0 ( 9S u p p l1 ) ：$ 5 1 5 5 堑，娶黧_ 璧鐾望登是旦粤番9 粤塞些箜翟三P 婴备兰n 伽篆= i ：= 篡= 絮= ；：竺嚣j 行了试验，结果表明，固定化酶和液态酶的水解产物具有 D ：r y 胁1 9 8 9 ；6 鬲：3 3 5 - 4 1 ”。 相同的性质，该试验所获得的固定化酶保持了原酶的功能 【l l 】R O S H I DA e ta 1 N t i ：p r 0 惦i I l s 柚da m i n o i d s M 】T o k y o ： 和性质，采用此方法固定化酶是可行的，并为进一步扩大J a p a n S e i P r e s s ，1 9 9 0 ：2 0 7 2 2 0 ( 上接第1 8 页) ， 自制成酵母曲，从中筛选出5 种酵母菌，尤以I 菌株性能 【4 】胡文浪梅酒酵母筛选、分离、纯化、选育应用【J 】酿酒科技，2 0 0 2 为最佳，其糖化力、蛋白酶活力和发酵力都很高。 ( 4 ) 3 3 - 3 4 ! ：2 采用4 登3 水平政试验分别确定了麸曲酱香酒瞄