2012.11.7植物的组织培养-菊花.ppt

植物组织培养,实验六,（设计性实验）,一、配制培养基 二、无菌操作 三、无菌培养 四、观察记录 上交实验报告时间：第15周,实验安排,本周六下午 2：30；3：30。,本周（第九周）（11.511.9）,第11、12、13、14周每周进行观察 （11.1912.14）,（1）深刻理解植物组织培养的基本概念和理论依据。 （2）训练利用实验室的条件来合理设计和完成实验的基本技能。,实验目的,植物组织培养就是将植物离体的生活部分（如器官、组织、细胞甚至原生质体等）通过无菌操作接种在适宜的培养基上，在人工控制的条件（如温度、光照、湿度等）下进行培养的技术。 理论依据：植物细胞的全能性。 植物体的每一个细胞都携带着一套完整的基因组，并具有发育成完整植株的潜在能力。,实验原理,完整植株,脱分化,再分化,外植体,愈伤组织,芽、根,实验设计的依据,依据一,分化,植 物 组 织 培 养 的 过 程,接种,脱分化,再分化,愈伤组织,外植体,再分化,冲洗,表面消毒,培养基中植物生长物质的种类和浓度在脱分化和再分化中起重要作用，尤其是生长素和细胞分裂素类的比例。,实验设计的依据,依据二,生长素类/细胞分裂素类,高 诱导根的分化 中 愈伤组织生长不分化 低 诱导芽的分化,MS培养基的大量元素； MS培养基的微量元素； MS培养基的铁盐； 有机附加成分； 2,4-D、NAA 、6-BA； 蔗糖、冷凝脂； 0.1mol/LNaOH和0.1mol/LHCl。,条件一：实验药品,实验条件,条件二：实验仪器及设备 烧杯、移液器、量筒、精密电子天平、三角瓶、pH试纸、封口膜等； 高压灭菌锅； 无菌操作间、超净工作台； 能够控制光照和温度条件的培养室。,实验条件,要求 1.以菊花无菌苗为材料进行以下培养基的设计。 （1）诱导菊花无菌苗叶片形成愈伤组织 （2）诱导菊花无菌苗茎段形成苗,实验设计,菊花无菌苗,实验材料,具体做法 全班分成小组，根据设计要求结合实验原理、设计依据及已提供的实验条件，在查阅资料的基础上，合理设计实验（主要对培养基进行设计）。 设计出初步方案后，每组推选一名代表向全班汇报设计的原理、方案和预期的结果；再经全班讨论确定最后的设计方案。,全班分成6个小组，按照要求经查阅资料、代表汇报和全班讨论，最后确定设计的培养基如下（MS为基本培养基）： 1.诱导菊花无菌苗叶片形成愈伤组织 （1）MS + 6-BA 1 + NAA 0 （1组，7人） （2）MS + 6-BA 1 + NAA 2 （2组，7人） （3）MS + 6-BA 1 + NAA 4 （3组，7人） 2.诱导菊花无菌苗茎段形成芽 （4）MS + 6-BA 0 + NAA 0.2 （4组，7人） （5）MS + 6-BA 0.2 + NAA 0.2 （5组，7人） （6）MS + 6-BA 2 + NAA 0.2 （6组，7人） 根据设计的培养基，利用提供的实验条件，我们将按照下列步骤完成实验。,一、配制培养基 二、无菌操作 三、无菌培养 四、观察记录,实验步骤,一、配制培养基 1.配制母液,实验步骤,MS培养基的大量元素母液（20）； MS培养基的微量元素母液（100）； 有机附加成分母液（100）； 肌醇母液（100）； MS培养基的铁盐母液（200）； 6-BA、2,4-D、NAA母液(0.5mg/mL)。,2.配制培养基 各个小组根据自己的设计方案进行。 要求：每一种培养基400mL，分装10瓶，每瓶40mL，每瓶做好标记，如：1，2，。 （1）加溶液。顺序为：大量元素微量元素附加成分肌醇铁盐植物生长调节剂蔗糖冷凝脂 （2）搅拌混匀; （3）定容至400mL； （4）调pH值至5.86.2； （5）分装、封口。,3.培养基灭菌 高压灭菌(压力1.1 kg/cm2 , 121, 20min )。湿热灭菌,各物质加入量： 400mL 大量元素母液（10） 100mL/L -40 mL; 微量元素母液（100） 10mL/L -4 mL ； 有机附加成分母液（100） 10mL/L -4 mL ； 蔗糖(30g/L)、冷凝脂(6g/L) 12g、2.4g; 肌醇母液（100） 10mL/L -4 mL ； 铁盐母液（200） 5mL/L -2 mL ； 6-BA、2,4-D、NAA母液(0.5mg/mL),表 培养基中植物生长调节剂加入量,二、无菌操作 1.接种前的准备 （1）空间灭菌(30min)。无菌操作间和超净工作台。 开紫外灯开鼓风机关紫外灯10min后开日光灯。 （2）操作人员的准备 剪指甲用肥皂彻底洗手35次自然风干进操作间用7075%酒精反复檫手(图)。 （3）器具灭菌 实验器械的消毒灭菌（图）。,2.接种 （1）切取材料 左手持镊，右手持刀切取材料叶片：0.5cm0.5cm，茎段带一个腋芽。,（2）接种 取三角瓶打开封口膜接种,叶块：正接，每瓶3块 茎段：形态学下端插入培养基，每瓶3个,（3）重新封口 （4）做标记 班级，日期,三、无菌培养 将接种好的三角瓶置于培养室进行培养。 培养条件：光/暗 = 14 h/10 h； T = 25 ； RH(relative humitidy) = 70 80% 四、观察记录,在培养过程中，每周定时观察记录实验结果1次。 内容： （1）污染率 污染率(%)=(污染的瓶数/接种瓶数) 100% （2）愈伤组织形成的时间、部位、颜色、大小、形状，计算出愈率。 出愈率(%)=(产生愈伤组织的叶块数 / 接种的叶块数)100% （3）芽形成的时间、芽数、叶数、丛生芽数，计算出芽率。 出芽率(%)=(出芽的茎段数 / 接种的茎段数)100%,（1）比较不同的培养基对愈伤组织形成的影响； （2）比较不同的培养基对芽形成的影响。,结果分析与讨论, 你认为组织培养获得成功的关键因素 有哪些？,本次实验历时6周，在此过程中大家经历了大量查