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响应曲面法优化亚麻籽蛋白提取工艺徐江波1，2，肖江1，2，陈元涛1，2*，张炜1，2，郭智军1，2 (1.青海师范大学润德亚麻籽工程技术研究中心 ，青海 西宁 810008；2. 青海师范大学化学系，青海 西宁 810008)摘要：以亚麻籽为原料，采用碱溶酸沉法提取亚麻籽蛋白。在单因素试验的基础上，应用响应曲面法研究浸提温度、pH、时间、料液比对亚麻籽蛋白提取率的影响，并建立该工艺的二次项模型。结果表明，回归模型具有高度显著性，可以对亚麻籽蛋白的提取率进行很好的分析和预测，并最终确定亚麻籽蛋白最佳工艺条件为：料液比1：20，提取时间90min，提取温度50，浸提液pH值为10，在此条件下的亚麻蛋白提取率为79.26%，纯度达到92.34%。关键词：亚麻籽；亚麻籽蛋白；碱溶酸沉；提取；响应曲面 Optimization of extraction processing for flaxseed protein by response surface methodologyXU Jiang-bo1,2, XIAO Jiang1,2, CHEN Yuan-tao1,2*, ZHANG Wei1,2, GUO Zhi-jun1,2 (1. Runde Engineering technology research Center of Flaxseed, Qinghai Normal University, Qinghai Xining 810008, P.R. China;2. Department of Chemistry, Qinghai Normal University, Qinghai Xining 810000, P.R. China)作者简介：徐江波(1983)，男(汉)，河北邯郸人，硕士研究生，主要从事青藏高原特色资源研究与开发；基金项目：青海省重点科技攻关项目(2007-N-120)；科技部科技人员服务企业行动项目(2009GJG20017)；教育部“新世纪优秀人才”支持计划(NCET-07-0476)。*通讯作者：陈元涛(1973)，男，教授，博士，研究方向为天然产物化学。E-mail：Abstract: Alkali-solution and acid-isolation was used to extract flaxseed protein from flaxseed in this study. Based on singer factor test, response surface method was used to study effects of extraction temperature, extraction pH, extraction time and solid-liquid ratio on extraction rate of flaxseed protein, and a second order quadratic equation for flaxseed protein extraction was finally obtained. The results showed that the model was of great difference, and the extraction of flaxseed protein from flaxseed was analyzed and predicted by the model. The optimum extraction of flaxseed protein from flaxseed were solid/liquid ratio(g/mL)1:20, extraction time 90 min, extraction temperature 50, extraction pH 10.0, the extraction rate of flaxseed protein from flaxseed was 79.26% and purity reached 92.34% under the optimal conditions.Key words: flaxseed; flaxseed protein; alkali-solution and acid-isolation; extraction; response surface method亚麻（Linum usitatissimum L.），亚麻科、亚麻属的一年生或多年生草本植物1，主要分布在北美、印度、中国等国家，是世界上最古老的纤维作物，品种较多，已成为世界十大油料作物之一2-4。亚麻籽（flaxseed 或linseed）是亚麻的种子，含有油脂和蛋白质等营养成分。其中，脂肪占31.937.8%，含有多种脂肪酸，尤其不饱和脂肪酸含量很高；蛋白质占21.931.6%，含有几乎所有种类的氨基酸，且氨基酸的评分较高，具有很高的营养价值2；另外，亚麻籽中还含有一定量的亚麻籽胶，随品种和栽培区域不同而不同，约占种子质量的210%5。诸多文献6-9研究表明，油料蛋白质的提取主要有等电点沉淀、离子交换、碱溶酸沉法、反胶束溶液萃取、膜分离、酶法等方法，其中碱溶酸沉法是我国普遍采用的蛋白质提取工艺，该方法能够有效地提高蛋白质的提取率，充分利用蛋白质资源。响应曲面法（Response Surface Methodology）是利用合理的实验设计并通过对实验数据进行一定的处理，建立影响因素与响应值之间的函数关系，采用多元二次回归方程来拟合影响因素与响应值之间的函数关系，并通过对回归方程的分析来寻求最佳工艺参数，解决多变量问题，由于其精度高，目前在食品工业和天然产物开发研究过程中应用广泛10-11。目前，尽管亚麻籽中含有大量的亚麻籽蛋白,但在我国应用亚麻籽提取亚麻籽蛋白的文献很少,更未见有规模化生产亚麻籽蛋白的报道。这是由于亚麻籽中富含亚麻籽胶，其具有黏性大、吸水性强、乳化效果强等特点12-14，会造成亚麻籽蛋白在提取过程中乳化、难离心、不易过滤等问题。因此，在对亚麻籽进行蛋白质的提取过程中，应该先对亚麻籽胶进行预处理。本课题组首先采用果胶酶法15对亚麻籽进行脱胶预处理，然后粉碎脱脂后采用响应曲面分析法优化亚麻籽蛋白碱溶酸沉的工艺条件，探讨料液比、浸提pH、浸提时间和浸提温度四个因素对亚麻籽蛋白提取率的影响，确定最佳的工艺参数，为亚麻籽蛋白的进一步开发利用及规模化生产提供研究基础。1 材料与方法1.1原料与试剂亚麻籽 青海润德生物科技有限公司，挑选完整、饱满、无虫害的亚麻籽作为实验原料；果胶酶（酶活力10000u/mL）诺维信(中国)生物技术有限公司，盐酸、氢氧化钠、石油醚 北京化学试剂厂 ；以上试剂及其它化学试剂均为分析纯；蒸馏水 实验室自制。1.2 仪器与设备pH计 梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司；LXJ-64-01离心机 北京医疗仪器修理厂；分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；LGJ-22型冷冻干燥机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；双层玻璃反应釜 上海申生科技有限公司；K360 BUCHI步琪凯氏定氮仪 广州和竺生物科技有限公司；ZD-2上海雷磁自动电位滴定仪 上海恒磁电子科技有限公司；超级恒温器，上海市实验仪器厂；索氏抽提器；1.3 方法1.3.1 亚麻籽粉基本组成成分测量 水分测定：常压直接干燥法，参照GB 5009.3-2010；蛋白质的测定按照GB/T 5009.5-2010；灰分的测定采用灼烧重量法，按照GB/T 5009.4-2010；脂肪的测定采用索实提取器，按照GB/T 14772-2008；总纤维的测定按照GB/T 5009.10-2003。1.3.2 亚麻籽蛋白的制备 原料预处理 首先用果胶酶对亚麻籽进行脱胶处理，然后将脱胶干燥后的亚麻籽进行粉碎，并在常温下用石油醚脱脂3次，置于通风橱中12h以挥发溶剂，得脱脂粉，于冰箱5保存备用。脱脂亚麻籽粉中蛋白质含量采用凯式定氮法进行测定。 亚麻籽蛋白的制备工艺流程 亚麻籽果胶酶脱胶干燥粉碎(过80目筛)脱脂碱溶浸提离心等电点沉淀离心洗涤冷冻干燥亚麻籽蛋白粉 亚麻籽蛋白的具体提取步骤16-17 称取一定量脱胶脱脂亚麻籽粉与蒸馏水按一定料液比混合，用NaOH调至一定的pH，于一定温度下搅拌浸提30min，然后在以4000r/min离心20min。沉淀物再重复提取1次，合并2次上清液，用HCl调pH至等电点使蛋白质沉淀，再以4000r/min离心20min，用蒸馏水洗涤沉淀2次，再用NaOH回调至pH为7.0，搅拌使沉淀复溶后进行冷冻干燥，则可得到亚麻籽蛋白粉。1.3.3 碱溶酸沉提取亚麻籽蛋白试验 等电点的确定 称取10.0g亚麻籽脱脂粉，料液比为1:20，用NaOH调节pH值至10，控制温度为50下搅拌浸提30min，然后在以4000r/min离心20min。沉淀物再重复提取1次，合并2次上清液，分别取上清液9份各25mL，加盐酸调节pH值为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5后离心，弃上清液后称重，将上述过程重复一次，绘出沉淀量与pH值的曲线关系图，图中沉淀量最大时的pH值即为亚麻籽蛋白质的等电点。 料液比的确定 分别设定料液比为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30(g/mL)，50，pH值为10下浸提90min，研究料液比对蛋白质提取率的影响，确定最佳的料液比。 浸提pH的确定 料液比选择1:20，分别选择浸提pH值为8、9、10、11、12、13，温度为50下浸提90min，研究浸提pH值对蛋白质提取率的影响，确定最佳的浸提pH值。 浸提温度的确定 料液比选择1:20，分别选择浸提温度为20、30、40、50、60、70，pH为10下浸提90min，研究浸提温度对蛋白质提取率的影响，确定最佳的浸提温度。 浸提时间的确定 料液比选择1:20，分别选择浸提时间为30、50、70、90、110、130min，在pH为10和温度为50下，研究浸提时间对蛋白质提取率的影响，确定最佳的浸提时间。1.3.4 碱溶酸沉工艺优化试验 依据单因素实验的结果，采用Box-Behnken进行试验设计，以料液比(g/mL)、浸提温度()、浸提pH及浸提时间(min)为影响因素，采用四因素三水平的响应曲面法进行试验，利用Design-Expert8.0.5b软件进行数据的处理和回归分析。分别用A、B、C、D来表示四个影响因素，并用+1、0、-1分别代表变量的水平，亚麻籽蛋白提取率为响应值，试验设计方案见表1。表1响应面设计实验因素与水平Table 1 Variables and levels in response surface design因素编码水平(xi)-10+1A料液比(g/mL)1:151:201:25B浸提温度()405060C 浸提pH91011D浸提时间(min)70901101.4 分析方法1.4.1 亚麻籽粗蛋白含量的测定 凯式定氮法；1.4.2 亚麻籽蛋白得率的计算亚麻籽蛋白得率(%) = 粗提产物中蛋白质含量脱脂粉总蛋白质含量100%2结果与讨论2.1 脱胶脱脂亚麻籽粉基本组分测定结果对脱胶脱脂后的亚麻籽粉进行成分测定，结果见表2。表2亚麻籽粉基本组分Table 2 The basic components of flaxseed meal成分水分脂肪蛋白质灰分总膳食纤维碳水化合物含量(%)1.520.5741.457.6140.548.312.2 亚麻籽蛋白等电点的测定图1 亚麻籽蛋白等电点Fig.1 The isoelectric of flaxseed protein 碱溶酸沉法提取蛋白质的过程中，加酸至等电点是非常关键的一步。在等电点时，蛋白质的沉淀量会达到最大值。从图1中可以看出，当酸沉pH值达到4.5时，亚麻籽蛋白的沉淀量最大，故我们选择酸沉pH为4.5作为亚麻籽蛋白的等电点。2.3 蛋白质提取单因素实验结果2.3.1 料液比对蛋白质提取率的影响按照方法进行试验，得到料液比对蛋白质提取率的影响试验结果如图2所示。图2 料液比对蛋白质提取率的影响Fig.2 Relationship between ratio of flaxseed to solution and extraction rate of flaxseed protein 从图2可以看出，蛋白质提取率随着料液比的增大而增加，当料液比增大到1：20时蛋白质提取率达到最大值，此后随着料液比的增大蛋白质提取率已趋于平衡，没有明显变化。因此，考虑到经济成本及后续实验的处理过程，本实验选择料液比为1：20作为最佳的料液比参数。2.3.2 浸提pH对蛋白质提取率的影响 按照方法进行试验，得到浸提pH值对蛋白质提取率的影响试验结果如图3所示。图3 浸提pH对蛋白质提取率的影响Fig.3 Relationship between extraction pH and extraction rate of flaxseed protein 由图3可以看出，随着浸提pH值的升高，亚麻籽蛋白提取率随之增加，在浸提pH=10时蛋白质提取率达到最大值。当浸提pH继续增大，蛋白质提取率反而会下降，造成的原因可能是浸提pH值太高引起了部分蛋白质变性，使得提取率反而会下降。因此，本实验选择浸提pH=10作为最佳的浸提pH值。2.3.3 浸提温度对蛋白质提取率的影响按照 方法进行试验，得到浸提温度对蛋白质提取率的影响试验结果如图4所示。图4 浸提温度对蛋白质提取率的影响Fig.4 Relationship between extraction temperature and extraction rate of flaxseed protein 由图4可以看出，浸提温度对亚麻籽蛋白提取率有较大的影响。在2050，亚麻籽蛋白提取率随浸提温度的增大而增加，当温度达到50时，蛋白质提取率达到最大；当温度继续升高时，蛋白质提取率明显降低，造成该现象的原因是：当温度小于50时，随着温度的升高蛋白质的溶解度会随之增大，而浸提温度过高则导致部分蛋白质发生变性，反而不利于提取。因此，本实验选择浸提温度为50作为最佳的浸提温度。2.3.4 浸提时间对蛋白质提取率的影响按照方法进行试验，得到浸提时间对蛋白质提取率的影响试验结果如图5所示。图5 浸提时间对蛋白质提取率的影响Fig.5 Relationship between extraction time and extraction rate of flaxseed protein由图5可以看出，当浸提时间小于90min时，亚麻籽蛋白提取率随着浸提时间的增长而提高；当浸提时间大于90min时，亚麻籽蛋白提取率有缓慢的下降趋势。原因可能是：当提取时间小于90min时，提取率比较低，这是由于亚麻籽脱脂粉的溶胀需要一定的时间；若时间过长，整个提取过程的平衡会被破坏，可能使部分蛋白质变性，而且浸提时间过长，从经济上考虑会增加生产成本，因此，综合各个因素考虑，本试验选择浸提时间为90min作为最佳的浸提时间。2.4 碱溶酸沉提取工艺的优化2.4.1 试验结果采用四因素三水平的响应曲面法进行碱溶酸沉提取亚麻籽蛋白工艺的优化，按照1.2.3的设计方案进行试验，结果见表3。表3方案设计及响应面法试验结果Table 3 Response surface experimental design and results实验序号A料液比(g/mL)B浸提温度()C浸提pHD浸提时间(min)提取率(%)1110059.372100176.833110064.144010154.485100177.276000083.217000078.658000079.399000078.4510001170.2811010163.3412011062.3913110067.1514101069.3415110071.2116001174.4617101070.7118100161.3819101060.3720001161.1121011069.6722101064.2823011056.2424010170.1725100173.1426011060.6927000079.6728001159.9829010160.322.4.2 模型的建立及显著性检验利用Design-Expert 软件对表2试验数据进行多元回归拟合，得到亚麻蛋白质得率对A料液比(g/mL)、 B浸提温度()、 C 浸提pH及 D浸提时间(min)的二次多项回归模型为： Y(%)= 78.69+3.85A3.27B+1.93C+1.58D+ 0.18AB0.56AC1.82AD0.71BC+3.17BD+5.91CD3.59A210.02B27.44C25.18D2。对该模型进行显著性检验及回归模型系数显著性结果（见表4）分析得出，该二次回归方程的模型项、一次项A、B，二次项 A2、B2、C2、D2和交互项CD都表现出极显著影响，一次项 C，交互项BD 都表现出显著影响，而且失拟项不显著，表明该模型有显著意义。为了简化二次回归方程，剔除偏回归系数不显著的 AB、AC、BC、AD 项，简化可建立如下二次回归模型为：Y(%)= 78.69+3.85A3.27B+1.93C+1.58D +3.17BD+5.91CD3.59A210.02B27.44C25.18D2。表4 实验结果的方差及显著性分析Table 4 Variance and significance analysis of the experimental results方差来源平方和自由度均方F值P值显著性回归模型1476.7214105.4815.710.0001*A177.871177.8726.490.0001*B128.511128.5119.140.0006*C44.70144.706.660.0218*D29.99129.994.470.0530*AB0.1310.130.0190.8930*AC1.25722*AD13.21113.211.970.1825*BC2.0012.000.300.5936*BD40.13140.135.980.0283*CD139.831139.8320.820.0004*A283.76183.7612.470.0033*B2650.881650.8896.930.0001*C2358.661358.6653.410.0001*D2174.361174.3625.970.0002*残差94.01146.72失拟性90.49109.0510.270.0191纯误差3.5340.88总差1570.7328注：*差异不显著(P0.05)，*差异显著(P0.05)，*差异极显著(P0.01)由表3 可以看出，回归模型具有高度的显著性（P0.9，表明模型充分拟合实验数据，因此二次模型成立，应用此模型可以分析和预测亚麻籽蛋白质碱溶酸沉提取工艺的优化。由表3拟合二次多项式模型的方差及显著性分析的结果可知，模型的一次项A、B均显著，C差异显著，D不显著，二次项均显著，交互相CD显著，BD为差异显著，其他交互相均不显著。由F值可知，影响亚麻籽蛋白提取率的因素依次为ABCD，即料液比浸提温度浸提pH浸提时间。2.4.3 两交互因素之间的作用等高线的形状反映了各因素之间交互效应的强弱大小，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形则表示两因素交互作用显著。由表4的显著性分析及等高线图可知，浸提时间和浸提温度（BD）、浸提时间和浸提pH（CD）的交互作用对亚麻蛋白质的提取率的影响显著。具体分析如下：图6 浸提时间和浸提温度交互作用对蛋白质提取率的影响Fig. 6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction temperature and time on extraction efficiency of flaxseed protein extraction yields图6表示料液比为1:20，浸提pH为10时，浸提时间与浸提温度对亚麻蛋白质的提取率的影响。当浸提时间一定时，亚麻蛋白质的提取率随着浸提温度的升高先增加后减小，在提取温度小于50时，亚麻蛋白质的提取量是随之增加的；当浸提温度一定时，亚麻蛋白质的提取量随浸提时间的增长而增大，当时间超过1.5h时，蛋白质提取率也会趋于平缓。图7 浸提时间和浸提pH交互作用对蛋白质提取率的影响Fig. 7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of extraction pH andtime on extraction efficiency of flaxseed protein extraction yields图7表示料液比为1:20，浸提温度为50时，浸提时间与浸提pH对亚麻蛋白质的提取率的影响。当浸提时间一定时，亚麻蛋白质的提取率随着浸提pH的升高先增加后减小，在提取pH小于10时，亚麻蛋白质的提取量是随之增加的；当浸提pH一定时，亚麻蛋白质的提取量随浸提时间的增长而增大，当时间超过1.5h时，蛋白质提取率也会趋于平缓。2.4.4 亚麻籽蛋白提取条件的优化通过用Design Expert 软件分析，碱溶酸沉提取亚麻籽蛋白的最佳工艺条件如下表：表5 最佳提取率的各个因素组合Table 5 Optimum extraction rate of various combinations of factorsABCD提取率(%)1.00-0.160.09-0.0279.26由表5可知，碱溶酸沉提取亚麻籽蛋白的最佳工艺参数为：料液比1：20(g/mL)，浸提温度为48.4，浸提pH为10.09，浸提时间为89.6min，在此条件下，亚麻籽蛋白的提取率理论值为79.26%。为了检验响应曲面法所得的结果的可靠性，采用上述优化提取条件进行亚麻蛋白质提取试验，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为：料液比1：20(g/mL)，浸提温度为48，浸提pH为10，浸提时间为90min。在此条件下进行提取，实际测得的亚麻蛋白质的提取率为78.47%，与理论值比较接近。因此，建立的二次型模型与实际情况基本吻合。3 结论（1）本实验采用响应曲面法对碱溶酸沉法提取亚麻籽中的蛋白质工艺进行分析优化，建立的二次多项式数学模型具有良好的显著性。碱溶酸沉提取亚麻籽蛋白的最佳工艺条件为：浸提温度为50，料液比1：20(g/mL)，浸提pH为10，浸提时间为90min，理论上的亚麻蛋白质的提取率可达79.26%，实际其提取率为78.47%。同时，在本实验的范围内，各影响因素对蛋白质提取率的作用大小依次为：料液比温度浸提pH浸提时间。（2）利用果胶酶对亚麻籽进行脱胶的预处理之后，再来提取亚麻籽蛋白质，为亚麻籽蛋白资源的进一步开发提供基础理论研究技术。参考文献1 周瑞宝特种植物油料加工工艺M.北京：化学工业出版社.2010.2：370-3712 Be Miller J N1Industrial Gums M. 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