仙人掌苷对荔枝霜疫霉菌的生物活性和蛋白组学分析.pdf

_ C T a g R I C UL I UR A E l O R E n L I - S I H I C 华 北农 学报 2 0 1 1， 2 6( 6)： 1 9 6 2 0 0 仙人掌苷对荔枝霜疫霉菌的生物活性 和蛋 白组学分析 赖 多， 曹永军 ， 路 梦玲 ， 徐 汉虹 ( 华南农业 大学 ， 天然农药与化学生物学教育部重点实验室 ， 广东 广州 5 1 0 6 4 2 ) 摘要 ： 活性测定表 明仙人掌苷对荔枝霜疫霉菌菌丝生 长具有 良好 的抑 菌活性 ， E C 。 达到 1 7 3 5 2 Ix g m L 。为 了从 蛋 白质水平探讨 仙人掌苷 对荔枝霜疫霉菌 的抑菌机制 ， 利用蛋白质 双向电泳方法分析仙 人掌苷处理前 后荔枝霜疫 霉 菌蛋 白质组表达 的差异 ， 结合飞行质谱 以及数据库 检索鉴定 差异蛋 白。结果发现 ， 仙 人掌苷处理 后荔枝 霜疫霉 菌有 1 6个蛋 白发生 了显著变化 ， 其 中 1 1 个下调表达蛋 白， 4个上调表达蛋 白， 1 个诱导表达蛋 白。其 中鉴定 的 5种差 异蛋 白质为 ： 线粒体二羧酸载体蛋 白( D I C 1 ) 、 半胱氨酸合成酶 A、 A B C转运蛋 白( A B C F E F 一 3 ) 、 C l a s s I I I s t r e s s r e s p o n s e r e l a t e d A T P a s e以及假定蛋 白 B S U 3 1 0 3 0 。功能分析发现这些蛋 白在药物胁迫反应 、 氨基 酸与硫代谢 、 细胞膜药物运输外 排 、 能量代谢 等方 面发挥重要 的作用 。这为 阐明仙人掌苷对荔枝霜疫霉菌抑制作用的分子机理提供 了重 要参 考。 关键词 ： 仙人掌苷 ； 荔枝霜疫霉菌 ； 抑菌活性 ； 蛋白组 中图分类号： Q 7 8 文献标识码 ： A 文章编号 ： 1 0 0 07 0 9 1 ( 2 0 1 1 ) 0 5 0 1 9 6 0 5 Bi o a s s a y s a nd Pr o t e o mi c s An a l y s i s o f Pe r o no ph y t h o r a l i t c h i Tr e a t e d wi t h Ca c t i c i n L AI Du o ， C AO Yo n g j u n， L U Me n g l i n g， XU Ha n h o n g ( Ke y L a b o r a t o r y o f N a t u r a l P e s t i c i d e a n d C h e mi c a l B i o l o g y ， Mi n i s t r y o f E d u c a t i o n， S o u t h C h i n a A g r i c u l t u r a l Un i v e r s i t y， G u a n g z h o u 5 1 0 6 4 2， C h i n a ) Ab s t r a c t： Bi o a s s a y s s ho we d t h a t c a c t i c i n e x h i b i t e d g o o d a n t i mi c r o b i a l a c t i v i t y a n d EC5 0 wa s 1 7 3 5 2 z g mL To e x p l o r e t h e p r o t e i n- l e v e l a nt i mi c r o b i a l me c h a n i s m o f c a c t i c i n i n Pe r o n o ph y t h o r a l i t c hi ， t h e p r o t e o me o f P 1 i t c hi my c e l i u m t r e a t e d w i t h c a c t i c i n w a s a n a l y z e d b y t w o - d i me n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s ( 2 - D E) a n d MA L D I T O F - MS R e s u l t s i n d i c a t e d s i x t e e n p r o t e i n s p o t s s h o we d s i g n i f i c a n t a nd r e p r o d u c i bl e c h a n g e s a f t e r c a c t i c i n t r e a t me nt ， a mo n g wh i c h e l e v e n we r e d o wn- r e g ul a t e d， f o u r we r e u p r e g ul a t e d， a nd o n e wa s n e wl y i n d uc e d b y c a c t i c i n Fi v e s u c c e s s f u l l y i d e n t i fl e d p r o t e i n s w e r e a s s i g n e d a s m i t o c h o n d r i a l d i c a r b o x y l a t e c a r r i e r p r o t e i n ( D I C 1 ) ， c y s t e i n e s y n t h e t a s e A， A T P - b i n d - i n g c a s s e t t e t r a n s p o r t e r s(A B C F E F 一 3) ， c l a s s I I I s t r e s s r e s p o n s e - r e l a t e d A T P a s e a n d h y p o t h e t i c a l p r o t e i n BSU3 1 0 3 0Th e s e p r o t e i ns we r e i n v o l v e d i n dr u g s t r e s s r e s p o ns e， a mi n o a c i d a n d s u l f u r me t a b o l i s m ， me mbr a n e t r a n s p o r t a t i o n a n d d i s c h a r g e， a n d e n e r g y me t a b o l i s m Al t o g e t h e r ， t h e r e s u l t s p r o v i de d i mp o r t a n t i n f o r ma t i o n o n t h e mo l e c u l a r me c h a n i s ms o f a n t i mi c r o b i a l a c t i v i t y o f c a c t i c i n a g a i ns t P1 i t c h i Ke y wo r d s： Ca c t i c i n； Pe r o n o p h y t h o r a l i t c hi ； An t i mi c r o b i a l a c t i v i t y； P r o t e o me 荔枝霜疫霉病 ， 其病原为荔枝霜疫霉菌 ( P e r o n o p h y t h o r a l i t c h i ) ， 是荔枝最主要病 害之一 。该病 害可以为害荔枝的花和果 ， 花期发病 ， 造成大量的枯 花 ， 幼果期发病 ， 引起落果 ， 成熟期发病 ， 引起果实腐 烂 ， 严重影响荔枝 的生产 。因此 ， 荔枝 霜疫霉病 的有效防治是实现荔枝优质高产的一项重要措施 ， 对荔枝 霜疫 霉菌 的研究 具有 很重要 的经济意 义 。 仙人掌苷 ( C a c t i c i n ) 是本 实验室从 菊科 B r i c h e l l i a属植物假蒿中分离纯化得到的具有抗菌活性的 化合物 ， 实验室条件下发现仙人掌苷对荔枝 霜疫霉 菌具有较好的抑菌活性。仙人掌苷在医药上有抗氧 化活性的报道 ， 但是 尚没有对真菌抗菌抑菌活性 收稿 日期 ： 2 0 1 1 0 71 8 基金项 目： 国家 自然科学基金项 目( 3 0 5 7 1 2 3 5 )； 广东省农业领域重点项 目一农业公关“ 安全农业投入品开发” ( 2 0 0 9 A 0 2 0 1 0 1 0 0 3 ) 作者简介： 赖多 ( 1 9 8 4一) ， 男 ， 广东高州人 ， 博士 ， 主要从 事昆虫毒理学和抗性研究。 通讯作者： 徐汉虹 ( 1 9 6 1一) ， 男 ， 湖北仙桃人 ， 教授 ， 博士生导师， 主要从事天然农药与昆虫毒理学研究 。 6期 赖 多等：仙人 掌苷对荔枝霜疫霉 菌的生物活性和蛋 白组学分析 1 9 7 的报道。仙人掌苷对荔枝霜疫霉菌的抑菌作用机理 也尚未明确 ， 因此 ， 其作用机理的研究对于新型的杀 菌剂 开发 具有 重要 的理 论 指导 意义 。 杀菌剂可能作用于植物病原体生理代谢过程中 的各个环节。差异蛋白质组是蛋 白质组学研究的一 个主要内容， 其核心在 于寻找某种特定因素引起样 本 之 间蛋 白质 组 的差 异 ， 揭 示 并 验 证 蛋 白质组 在 生 理 或 病理 过 程 中 的 变 化 ， 它 已 经 广泛 应 用 于 植 物病原菌寄主的致病机理 和病原菌对杀菌剂 的 抗 性机 理 研 究 中 。 本 研究 拟通 过 蛋 白组 学 方法 分 离 、 鉴定 仙 人 掌 苷处理前后荔枝霜疫霉菌的蛋白质组 ， 建立药物处 理前后蛋白质组图谱 ， 比较差异表达的蛋白质 ， 寻找 药物作用的靶分子 ， 为进一步阐明潜在药物作用机 制 和新 药物 开发 提供 理论 依据 。 1 材料 和方法 1 1 试 剂与 仪器 超纯尿素购 自 S i g m a公 司； 两性 电解质 载体 购 自北京军事医学科学 院； 3 3 ( 一 ( 胆酰氨丙 基 ) ) 二 甲铵基 丙磺酸 内盐 ( C H A P S ) 购 自 A m r e s c o公 司； 丙烯酰胺 、 甲叉 双丙 烯 酰胺 、 三 羟 甲基 氨 基 甲烷 ( T r i s ) 、 过硫酸铵 ( A P S ) 、 四甲基 乙二胺 ( T E ME D) 、 甘 氨 酸 、 十 二 烷 基 磺 酸 钠 ( S D S ) 、 二 硫 苏 糖 醇 ( D T T ) 、 碘代乙酰胺 ( I A A) 等试剂均为分析纯 ， 购 自 北京鼎国公 司。D I Y- 1 0 C型微电脑控制电泳仪购 自 北京六一仪器厂 ； J Y - S X 3型双向电泳 系统购 自北京 君 意公 司 。 1 2菌丝 生长 与药 物处 理 称 取 1 0 m g化合 物仙 人 掌 苷 ， 加 入 1 mL D MS O 溶 解 ， 倒 入 5 0 预热 的 P D A培养基 ， 配成 1 0 0 g mL 带毒培养基 ， 昆 匀后倒入培养皿 中， 对照不加药。待 培养基凝固后在培养基表面贴上一层玻璃纸 。每个 培养皿分别接种 1 0 0 t x L荔枝霜疫 霉病菌孢子悬浮 液 ， 置于恒温培养箱 中( 2 5- 4- 1 ) ， R H 9 5 条件下 培养 。待菌丝生长出现明显抑制效果后 ， 刮下菌丝 ， 超纯水洗 涤菌丝 2次 ， 滤纸 吸干水 分称 重后 于 一 7 0 保存备用 。 1 3总蛋 白质样 品 的制备 取菌丝约 l g置于研钵 中， 液氮研磨成粉。加 人蛋 白提取液 ( 8 mo l L尿素 ， 4 0 m mo l L T r i s p H 8 8 ， 6 5 mm o l L D T T ) ， 充分悬浮。冰上超声 波处理 2 0 rai n ， 4 、 1 2 0 0 0 r m i n离 心 1 0 m i n ， 收集 上 清 ， 即 得 总蛋 白。按试 剂 盒 2 - D E C l e a n u p k i t ( A m e r s h a m) 说明书操作纯化总蛋 白， 蛋 白沉淀重溶于裂解液 ( 7 C T n 日 R I C U L T U R A E B n 砸 L I - S I # I O A m o l L尿素 ， 2 m o l L硫脲 ， 4 C H A P S ， 4 0 m mo l L T r i s pH 7 8。 6 5 mmo l L DT T， 2Amp h o l y t e pH 3 1 0 ) 或 一 7 0 c = 保存备用 。B r a d f o r d 法测定蛋白含量。 1 4双 向 电泳 第一向等 电聚焦参 照 C h a n等 方法稍 加修 改， 自制 I E F胶 条： 2 m L 3 0 A c r B i s ， 6 g超 纯尿 素 。2 7 m L去离 子水 ， 5 0 L N P - 4 0 ， 2 0 0 L p H 3 5 1 0和 5 0 L p H 4 6两性电解质 ； 聚焦电泳程序 为 ： 2 0 0 V X 3 0 rai n 、 4 0 0 V X 3 0 mi n 、 6 0 0 V 1 h 、 8 0 0 V 1 2 h 、 1 0 0 0 V 1 h 。第 二 向 S D S电泳 前 ， 将胶条依次放人 l D T T和 4 碘代乙酰胺的平衡 液 中各平衡 1 5 m i n 。平 衡 好 的 胶 条 置 于 1 2 5 凝 胶顶端 ， 0 5 琼脂糖封胶液固定后 电泳 。电泳结束 后 采用 B l u e s i l v e r 法 引 染 色 。 1 5差异 蛋 白点 质谱 鉴定 用 I m a g e Ma s t e r 2 D P l a t i n u m 5 0软 件 分 析 电泳 图谱 ， 选取差异明显的蛋白质点， 小心切割胶块 ( 约 0 61 m m ) ， 置 于 E p p e n d o ff管 中 ， 进行 脱 色 、 胶 内 T r y p s i n酶解和肽段提取。制备好 的样 品置 于德 国 B R U K E R F E F L E X MA L D I T O F M S质谱仪 上进 行肽质量指纹谱分析 ， 用基质峰和胰蛋 白酶 自动降 解离子峰作为 内标 校正质谱峰 ， 获得肽质指纹 图。 利 用 M A S C O T软 件 以及 S WI S S P O R T ， MS D B和 N C B I 等 3个数据库对获得的? 昆 合物肽段质量数据进 行检索。检索参数为 ： 最大允许 的肽质量误差为 0 5 ， 每个肽段允许有 1个不完全裂解位点 ， 固定修 饰选择羟 甲基 ( H y d r o x y m e t h y 1 ) 修饰 ， 可变修饰选择 氧化 ( O x i d a t i o n ) 修 饰 。 2 结果 与分析 2 1 仙人 掌苷对 荔 枝霜疫 霉 菌的抑 制效果 采用平板稀释法测定仙人掌苷对荔枝霜疫霉菌 的抑制活性 ， 结果表明， 仙人掌苷对荔枝霜疫霉菌菌 图 1 仙人掌苷对荔枝霜疫霉菌菌丝生长的抑制效 果 Fi g 1 I nhi bi t or y e f f e c t s o f c a c t i c i n t o my c e l i a l g r owt h o f P1 i t c hi C T一 H II I O U L T UR JE 1 9 8 B O R E 札I S I n IC _一 华北农学报 2 6卷 丝 生长具 有 明显 的抑 制 效果 。如 图 1所 示 ， 随着 仙 人掌苷浓度增加， 对荔枝霜疫霉菌菌丝生长的抑制 展现 明显 的抑 菌 效 果 ； 当 浓 度 达 到 5 0 0 x g m L时 ， 菌丝基本上无法生长。仙人掌苷抑制荔枝霜疫霉菌 作用呈正比。仙人掌苷浓度为 6 2 5 p g mL时已经 菌丝生长的毒力回归方程和 E c 。 见表 1 。 表 1 仙人掌苷对荔枝霜疫霉菌菌丝生长的半抑制浓度 Tab 1 ECs 0 o f c ac t i c i n t o my c e l i a l g r o wt h of P1 i t c hi 2 2 达谱 仙人掌苷处理后荔枝霜疫霉菌的差异蛋 白表 2 3 差异蛋白点的 MAL DI - T OF - MS分析 对仙人掌苷处理后的荔枝霜疫霉的样品和对照 样品的蛋 白质进行了双向电泳 ， 蛋 白质凝胶染色后 获得 背景 清晰重 复性 好 的蛋 白质 2 - D E图谱 ( 图 2 ) 。 用 I ma g e Ma s t e r 2 D - P l a t i n u m 5 0分析软件对图谱蛋 白点进行 分析 发现 ， 仙 人 掌苷 处 理 后 一些 蛋 白表 达 丰度存在 明显的差异。对照组与仙人掌苷处理组中 共有 l 6个差异蛋 白质点。其 中， 与对照组相 比， 仙 人掌苷处 理后 有 1 1 个 蛋 白质点 ( s p o t 11 1 ) 表 达下 调 ， 4个蛋 白质 点 ( s p o t 1 2l 5 ) 表 达 上调 ， 1 个 蛋 白 质点 ( s p o t 1 6 ) 为药 物诱 导产 生 。 这些蛋 白点在 2 - D E图谱表现上调或下调以及 诱导 ， 表明了荔枝霜疫霉在仙人掌苷作用下的蛋白 表达 发生 了变化 ， 反 映了其 生理 生化特 点 。 差 出 I E F 对提取物仙人掌苷处理后荔枝霜疫霉菌丝差异 表达的蛋 白质点进行肽质量指纹谱分析及数据库检 索 ， 最终有 5个蛋白质点得到了可靠的鉴定 ( 表 2 ) 。 部分蛋 白质点由于在 MA L D I T O F分析中肽质谱指纹 图分辨率 比较低 ， 灵敏度不够， 或者因为匹配率和覆 盖率太低未能成功鉴定， 还需要通过其他分析方法进 行逐 一证实 。 所鉴定的差异表达蛋白包括线粒体二羧酸载体 蛋 白( D I C 1 ) 、 半胱 氨酸合成 酶 A、 A B C转 运蛋 白 ( AB C F EF 一 3)、 C l a s s I I I s t r e s s r e s p o n s e - r e l a t e d A T - P a s e以及一个 未 知 功 能 的假 定 蛋 白 B S U 3 1 0 3 0 。经 过功 能分析 发现 这 些蛋 白在 药 物胁 迫 反 应 、 氨 基 酸 与硫代谢 、 细胞膜药物运输外排、 能量代谢等方面发 挥重 要 的作用 。 I E F 图 2 仙人掌苷处理荔枝霜疫霉菌丝的双向电泳图谱 ( 左为对照 。 右 为处 理) Fi g 2 Pr o t e o mi c s map s o f 2- DE s e pa r a t e d c on t or i a nd t r e a t m e nt wi t h 1 0 0 pg mL c ac t i c i n i n P 1 i t c hi 表 2差异蛋 白点质谱鉴定 Ta b 2 I d e nt i fic at i o n of t h e d i f f e r e nt i al l y e x pr e s s e d p r ot e i ns by M ALDI T0F- M S 3讨 论 景 萎 雾 本研究首次报道了仙人掌苷对荔枝霜疫霉菌菌 物作用 5 d后 ， 仙人掌苷处理组 和对照组蛋 白质具 丝生 长 具 有 良好 抑 菌 活 性 ， E C 。 达 到1 7 3 5 2 有差异 ， 表 明仙人掌苷处理后促进或抑制特定基 因 s I I s 6期 赖 多等 ：仙人掌苷对荔枝 霜疫霉 菌的生物活性和蛋 白组学分析 的表达 ， 这些差异表达蛋 白很可能与仙人掌苷的作 用 机制 有关 。 明显差异表达蛋 白主要是与细胞 能量代谢 、 药 物胁迫应激反应 、 细胞膜药物运输外排有关的蛋 白。 与细胞应激状态有关的蛋 白C l a s s I I I s t r e s s r e s p o n s e - r e l a t e d A T P a s e在仙人掌苷处理组中表达明显下降 ， 可能受到仙人掌苷对细胞的损害作用 ， 导致生物体 合成这类蛋白质的能力下降 ， 其具体的功能作 用还 需要 进一 步试 验研 究 。 能够同外界环境进行物质和信息交换是活细胞 的基本特征之一。通过这种物质和信息交换的生理 活动 ， 细胞能感受环境变化 ， 获取新陈代谢所必需的 营养物质 ， 并排 出代谢产物和废物 。细胞对溶质 的 选择性吸收和排放主要是通过细胞膜上 以膜转运蛋 白为基础 的运输 系统实现 的 。线粒体 二羧酸 载体蛋白( D I C) 与氧化磷酸化有关 ， 在真核生物 体 内参与三羧 酸循环过程 中磷酸盐 、 A D P A T P 、 苹 果酸 天冬氨酸 、 苹果酸 酮戊二酸进 出线粒体的转 运 。因此 ， 线粒体二羧酸载体蛋 白与生物体 内的 生物氧化及能量代谢息息相关。 腺苷三磷酸结合盒转运蛋 白属于一个非常大的 蛋 白家族 ， 由于含有一个腺苷三磷酸( A T P ) 的结合 盒 ( A T P b i n d i n g c a s s e t t e ， A B C ) 而 得 名 ， 具有 A T P结 合区域的单向底物转运泵 ， 以主动转运方式完成多 种分子的跨膜转运 。至今 已经在如构巢曲霉 、 酿酒 酵母菌 、 虱状赤霉 、 指状青霉、 葡萄灰霉、 禾生球腔菌 等很多丝状真菌 中发 现 A B C转 运蛋 白的存在 。 一 方面 ， A B C转运蛋 白参与生物体 内代谢过程中阳 离子的跨膜运输 和 A T P的水 解 ， 为生 物体 的正 常代 谢提 供能量 及 脂肪 酸代谢循 环 中的 B 一 氧 化 等代谢活动； 另一方面， 利用水解 A T P的能量 对溶质中各种生物分子进行跨膜转运 ， 其转运 的底 物包括 ： 糖 、 氨基酸、 金属离子、 多肽、 蛋 白质、 细胞代 谢 产 物 和药 物 等 。A B C转 运 蛋 白能 够 将 药 物 从真菌体内泵出到体外 ， 减少药物向真菌体 内的运 输与积累。一些研究结果证 实了 A B C转运蛋 白对 植物病原真菌成功侵染寄主和抗药性的产生都有重 要 的意 义 。如 S k o v等 利 用 基 因缺 失 突 变体 证 实 A B C转运蛋 白在大刀镰刀菌对小麦 的侵染 过程 中 发挥着重要的作用。H a y a s h i 等 发现对甾醇脱 甲 基抑制剂类杀菌剂恶咪唑产生抗药性的葡萄灰霉病 菌 中 A B C转 运蛋 白基 因的 转 录 和 表 达 明 显较 敏 感 型的增加 。研究人员通过基 因克隆等技术 ， 研究 了 指状青霉菌和葡萄灰霉病菌 A B C转运蛋 白基 因突 变体对恶咪唑等的抗药性 ， 结果 A B C转运蛋 白基 因 C T n 卟 I C U L T U R E 蚰脏札l - S 哪I 蚰 缺失体对杀菌剂表现敏感 ， 并且在真菌体 内有大量 杀菌剂的积累， 而过量表达 的突变体则 明显产生抗 药性 。 仙人掌苷处理荔枝霜疫霉病菌后 ， 荔枝霜疫霉 菌蛋 白质 组 出现 了差 异 表 达 ， 表 明仙 人 掌 苷处 理 后 促进或抑制了特定基因的表达， 这些差异表达蛋 白 与仙人掌苷抑制荔枝霜疫 霉病菌的作用机制有关 。 蛋白点 1和 5为药物下调表达蛋 白， 表明仙人掌苷 抑制了线粒体二羧酸载体蛋 白( Mi t o c h o n d r i a l d i c a r b o x y l a t e c a r r i e r p r o t e i n ， D I C 1 ) 和腺苷三磷酸结合盒 转运 蛋 白 ( A T P b i n d i n g c a s s e t t e t r a n s p o r t e r s ， A B C F - E F 3 ) 这 2种蛋 白质 的表达 。因此初步推断 ， 仙人 掌苷对荔枝霜疫霉病菌的作用机理可能是一方面抑 制 了病原菌的生物氧化及能量代谢 ， 直接作用于病 原菌的正常生理代谢功能 ； 另一方面 ， 仙人掌苷抑制 病原菌的自我保护机制 ， 使其不能完成解毒排毒的 代谢过程 ， 从而产生抑制病原菌的效果 。 参 考 文献 ： 1 岑贞陆 ， 黄思 良 一种 高效分 离荔 枝霜疫 霉病 菌 的新 方法 J 植物保护 ， 2 0 0 8 ， 3 4 ( 6 ) ： 1 3 71 3 8 2 陶挺燕 ， 何 凡 ， 范鸿雁 ， 等 几种杀 菌剂 对荔 枝霜疫 霉病的室 内毒力测定 J 农药 ， 2 0 1 0 ， 4 9 ( 1 ) ： 7 2 7 3 3 K i m K S ， L e e S ， L e e Y S ， e t a 1 A n t i o x i d a n t a c t i v i t i e s o f t h e e x t r a c t s f r o m t h e h e r b s o f A r t e mis i a a p i a c e a J J Et h n0 p h a r m8 c o l ， 20 03， 85： 6972 4 孙言伟 ， 姜颖 ， 贺福初 差异蛋 白质组学 的研究进展 J 生命科 学 ， 2 0 0 5， 1 7 ( 2 ) ： 1 3 71 4 0 5 潘怡欧 ， 刘 琳琳 ， 张炬红 ， 等 茉 莉酸 诱导 的拟南 芥 叶 片蛋 白质组分析 J 华 北农 学报 ， 2 0 1 0 ， 2 5 ( 2 ) ： 3 5 39 6 F e r n a n d e z A c e r o F J ， J o r g e I ， C a l v o E， e t a 1 P r o t e o m i c a n a l ys i s o f p hy t 0 pa t h o g e n i c f u n g us Bo t r y t i s c i n e r e a a s a p o t e n t i a l t o o l f o r i de n t i f y i ng pa t ho g e n i c i t y f a c t o r s， t he r a pe u- t i c t a r g e t s a n d fo r b a s i c r e s e a r c h J A r c h M i c r o b i a l ， 2 00 7， 1 8 7： 2 0 721 5 7 K i m S T ， Y u S ， K i m S G， e t a 1 P r o t e o m e a n a l y s i s o f r i c e b l a s t f u n g u s ( Ma g n a p o r t h e g r i s e a )p r o t e o m e d u r i n g a p p r e s s o r i u m f o r m a t i o n J P r o t e o m i c s ， 2 0 0 4 ， 4 ( 1 1 ) ： 3 5 7 9 3 5 87 8 谢娟 ， 黄 明星 ， 卢代 华 ， 等 水 稻稻瘟 菌抗 性相关 蛋 白的双 向电泳分 析 J 中国生 物工 程杂 志 ， 2 0 0 6 ， 2 6 ( 1 2)： 9 29 8 9 皇甫海燕 ， 官 春云 甘蓝 型油 菜抗 菌核病 近等 基 因系 和感病亲本蛋 白差异 的初 步研 究 J 中国农业 科学 ， 2 0 1 0， 4 3 ( 1 0 )： 2 0 0 02 0 0 7 1 0 C a m p o S ， C a r r a s c a l M， C o c a M， e t a 1 T h e d e f e n c e r e - s po n s e o f g e r mi n a t i n g ma i z e e mb r y o s a g a i n s t f un g a l i n n C T 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 0 华北农学报 2 6卷 f e c t i o n ： a p r o t e o m i c s a p p r o a c h J P r o t e o m i c s ， 2 0 0 4 ， 4 38 33 9 6 C h a n z L ， Wa n g Q ， X u X B， e t a 1 F u n c t i o n s o f d e f e n s e - r e l a t e d p r o t e i ns a nd d e h y d r o g e n a s e s i n r e s i s t a n c e r e s p o n s e i n du c e d b y s a l i c y l i c a c i d i n s we e t c h e r r y f r u i t s a t d i f f e r e n t m a t u r i t y s t a g e s J P r o t e o mi c s ， 2 0 0 8 ， 8 ： 4 7 9 1 4 80 7 Ca n d i a no G， Br us c hi M ， Mu s a n t e L， e t a1 Bl u e s i l v e r ： a v e ry s e n s i t i v e c o l l oi d a l Co o ma s s i e G- 2 50 s t a i n i n g f o r p r o t e o m e a n a l y s i s J E l e c t r o p h o r e s i s ， 2 0 0 4 ， 2 5 ： 1 3 2 7 1 3 3 3 Da h l S G ， S y he I， Ra n v n a A W S t r uc t u r e s a nd mo d e l s o f t r a n s p o r t e r p r o t e i n s J J P h a r m a c o l E x p T h e r ， 2 0 0 4 ， 3 0 9( 3 )： 8 5 38 6 0 谢浩 ， 李 其 昌， 郭 小 明 膜 转运蛋 白的功能 性超表 达和纯化 J 中国生 物化学与 分子生物学 报 ， 2 0 0 7 ， 2 3 ( 1 2 )： 1 0 5 11 0 5 8 L a n c a r Be n b a J ， F o u c h e r B， S a i n t Ma c a ry M C h a r a c t e r i z a t i o n， p u r i f i c a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f t he y e a s t mi t o c ho n - d r i a l d i c a r b o x y l a t e c a r r i e r( S a c c h a r o my c e s c e r e v i s i a e) J B i o c h i mi e ， 1 9 9 6 ， 7 8 ： 1 9 5 2 0 0 St e r g i o p o u l o s I ， Z wi e r s L H ， De Wa a r d M AS e c r e t i o n o f na t u r a l a nd s y n t h e t i c c o mpo u n d s f r o m f i l a me n t o u s f un g i by me mb r a n e t r a n s p o r t e r s o f t he ATP b i nd i n g c a s s e t t e a n d ma j o r f a c i l i t a t o r s u p e ff a m i l y J E u r J P l a n t P a t h o l ， 2 0 02， 1 0 8： 71 9 7 3 4 Ma mn u n Y M ， Sc h l l e r C， Ku c h l e r K Ex pr e s s i o n r e g u l a t i o n o f t h e y e a s t P D R 5 A T P b i n d i n g c a s s e t t e( A B C) t r a n s po r t e r s ug g e s t s a r o l e i n c e l l u l a r d e t o x i fi c a t i o n d u r i n g t h e e x p o n e n t i a l g r o w t h p h a s e J F E B S L e t t ， 2 0 0 4， 5 5 9( 13) ： 1 1 11 1 7 Ha n e k o p N， Z a i t s e v a J ， J e n e we i n S， e t a 1 Mo l e c u l a r i n s i g h t s i n t o t he me c h a ni s m o f ATP h y dr o l y s i s b y t h e NBD o f t h e A B C t r a n s p o r t e r H l y B J F E B S L e t t ， 2 0 0 6 ， 5 8 0 ( 4) ： 1 0 3 61 0 4 1 Th e o d o u l o u F L， Ho l d s wo rth M ， Ba ke r APe r o x i s o ma l 2 O 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 A B C t r a n s p o r t e r s J F E B S L e t t ， 2 0 0 6 ， 5 8 0 ： 1 1 3 9一 l 1 55 王华丙 ， 张振义 ， 包锐 ， 等。 A B C转运 蛋白的结构 与 转运机制 J 生命 的化学 ， 2 0 0 7 ， 2 7 ( 3 ) ： 2 0 8 2 1 0 乌艳红 ， 米福贵 ， 李 志明 ， 等 紫花苜蓿 铝激活苹果 酸 转运蛋 白基 因 的克 隆 与亚 细胞 定 位 J 华北 农 学 报 ， 2 0 1 1 ， 2 6 ( 1 ) ： 7 2 7 7 孟成 生， 李爱 丽 ， 王省芬 ， 等 小 麦脂质转 运蛋 白 c D N A结构