微生物发酵法生产EPA及DHA的研究进展.pdf

微生物发酵法生产 E P A及 D HA的研究进展 刘长海 杜冰 姚 汝华 ( 1 仲 恺农业技 术学院食品系 广州 5 1 0 2 2 5 ； 2 华南理工大学食品与生物 工程 学院 广州 5 1 0 6 4 0 ) 一良 品 技 7 I 【 摘要：E P A和 D H A是两种人体必需多不饱和脂肪酸，对人体健康有重要 意义，微生物发酵法生产 E P A和 DH A具有稳定性好 、易于分离纯化和工业化等优点 ， 是近年来研究的热点。从微生物利用 葡萄糖合成多不饱和脂肪酸的代谢途径和影响微生物合成多不饱和脂肪酸的因素 出发，论述 了微 生物发酵法生产 E P A和 D HA的研 究现状和最新进展 。 关键词：二十碳五烯酸；二十二碳 六烯酸；微生物发 酵 中图分类号：T S 2 0 1 3 文献标识码 ：A 文章编号：1 0 0 5 9 9 8 9 ( 2 0 0 4 ) 0 6 0 0 1 3 0 4 Ne w d e v el o p men t i n pr o du c t i on o f DHA a n d EP A b y mi c r o o r g an i s m f e r me n t a t i o n LI U Ch a ng ha i DU Bi n g YAO Ru h ua ( 1 D e p a r t me n t o f F o o d S c i e n c e ， Z h o n g k a i A g r i t e c h n i c a l Co l l e g e ， Gu a n g z h o u ， 5 1 0 2 2 5 2 Co l l e g e o f F o o d E n g i n e e r i n g a n d B i O t e c h n O I O g y ， So u t h Ch i n a Un i v er s i t y o f T e c h n o l o g y ， Gu a n g z h o u ， 5 1 0 6 4 0 ) Ab s t r a c t ： EP A a n d DHA a r e t wo k i n d s o f es s en t i a l p OIy u n s a t ur a t e d f a t t y a c i d s ， a n d h a v e i mp or t a n t e ff e c t o n b o d y h e a l t h Th e pr o d u c t i on o f EP A a n d DHA b y mi c r o or g an is m f e r me n t a t i o n h a s ma n y s u p er i or it i e s s u c h a s g o o d s t a b i l i t y 。 b e i n g p r o n e t o s e p a r a t i o n， p ur i f i c a t i o n a n d i n d u s t r i a I i z a t i O n I t is a r e s e ar c h h o t s p o t i n r e c e n t y e a r s Th i s p a p e r t r e a t e d t h e me t a b ol i c r o u t e a n d t h e i n f l u e n c i n g f a c t o r s o f p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s s y n t h e s i z e d b y mi c r o o r g a n i s m f r O m g l u c o s e Th e r e c e n t s it u a t ion an d n e w d e v elo p me n t o f r e s e a r c h o f p r o du c t i o n o f DHA an d EP A b y mi c r o o r g a n i s m su b m e r g ed t e r men t a t i on wer e r e v i e w e d、 Ke y w o r d s ： e i c o s a p e n t a e n o i c a c i d( E P A ) ； d o c o s a h e x a e n o i c a c id( DH A ) ； mic r o o r g a n i s m f e r me n t a t i o n 0 前言 二十碳 五烯酸( E P A) 和二十二碳 六烯酸( DHA) 是在海洋动物及植物性浮游生物中普遍含有的两种 一 3系列不饱和脂肪酸( P U F As ) ，它们是人体的两大 必需脂肪酸( E s s e n t i a l F a t t y A c i d ) ，对防治心血管疾 收稿 日期 ：2 0 0 3 1 2 1 8 基金项 目：国家 “ 九五 ”科技攻 关项 目( 9 6 一 C0 3 0 1 0 4 ) 。 作者简介 ：刘长海( 1 9 5 5 一 ) ，男，副教授 ，研究方向为食品工程 及发酵食品。 病有着非常重要的作用。近年来，随着它们 的营 养及医药作用被进一步 的研究，其抗炎、抗癌、避 孕及促进大脑发育 的作用也逐渐被人们发现 ， 因而 备受青睐。 它们 的商业来源长期以来只来 自海洋鱼 类及它们的油中，如鲭鱼、沙丁鱼、金枪鱼以及松 鱼等均含有较高的脂肪组织 ， 在许多国家都被用来 生产鱼油及 D H A、E P A 系列产 品。但由于每种来 源 的鱼油中的 一 3脂肪酸的含量因鱼 的种类 、季 节 、捕捞的地理位置不同而异 ，造成 D HA、E P A 的含量并不稳定， 而且由于鱼油 固有 的鱼腥味和氧 维普资讯 嗣 品 技 7 I c 化不稳定性 ，因此寻找 E P A、DH A 的商业化生产 的可替代性来源 受到 了广泛关注 】 。 海洋鱼类 自身并不能合成 E P A 和 DH A，它们 必须从其海洋食物链 中获得这些脂肪酸 ，在海洋食 物链中 E P A和 D HA 的主要生产者是海洋藻类 。在 许多种植物性浮游生物及海藻中己发现含有高水平 的 E P A 和 DH A，研 究表 明在鱼和动物性浮游生物 中这两种酸 的含量与在相同水域中的一些海藻中的 相同。除海洋藻类外 ，有好几种海洋微生物含有大 量的 E P A 和 D HA，它们都是商业化生产 E P A 和 D HA的可能性来源L 3 1 。 1 微生物生物合成 E P A和 D HA的代谢途径 葡萄糖 E MP l l H MP 磷酸烯醇式丙酮酸 l 丙酮 酸 l 乙酰 Co A l乙酰 c 0 A羧化酶 丙二 酰 单 酰一 AC P l 硬 脂 酸 ( 1 8：0 ) l 油 酸( 2 1 8：1 ) l 2 脱羧酶 l 亚 油 酸 6 脱氢酶 v 一亚麻 酸 ( 9 ， 1 2 -1 8：2 ) ( 6 ， 9 ， 1 2 -1 8： 3 ) 1 5 脱氢酶 l l 0 c ， 亚麻 酸 二 高 Y一 亚麻酸 ( 9 ， 1 2 ， 1 5 1 8： 3 ) ( 8 ， 1 1 ， 1 4 2 0： 3 ) 一前列腺素 l l E P A 花 生 四烯 酸 ( 5 , 8 ， 1 1 ， 1 4 ， 1 7 2 0 ： 5 ) ( 5 , 8 ， 1 1 ， 1 4 2 0： 4 ) l DHA ( 4 ， 7 ， 1 0 ， 1 3 ， 1 6 ， 1 9 2 2：6 ) 图 1 微 生物利用葡 萄糖合成多不饱和脂肪 酸的代谢途径 微生物通常也是从单不饱和脂肪酸油酸开始， 用与高等生物 同样的酶系合成多不饱和脂肪酸，在 这个途径 中主要有两种酶反应链的延长和脱饱 和 ，它们分别由相应的膜结合延长酶和脱饱和酶所 催化，链的延长即从供体 乙酰 C o A 或丙酰 C o A 引 入两个 C原子延长碳链 ，而脱饱和体系 由微粒体膜 结合 的细胞色素 b 5 ，NA DH一 细胞色素 b 5还原酶和 。 。 彝 溆 。 | t 脱饱和酶组成 。这两种酶反应相结合 ，通过在油酸 链上两个脱饱和反应引入两个双键后进一步 的链 延 长和脱饱和产生 E P A和 DH A。 2 影响多不饱和脂肪酸合成的因素 微生物的脂肪酸组成 ，无论从数量上还是从质 量上讲都受环境 的影响，在大多数微生物 中多不饱 和脂肪酸 的生物合成和积累的影响参数主要有培养 基组分、通风、光强度、明暗循环( 对光合微生物而 言) 、温度 、菌龄等因素 。 2 1 培养基组分 据报道 ，在培养基 中的氮含量影响绿藻、细菌 、 真菌中的饱和及不饱和脂肪酸之 比。 在氮含量低时， Bo t r y o c o c c u s b r a u n i 、Du n a l i e l l a b a r d a wi l 和 D s a l i n a 的 E P A 含量增加 ；相反，淡水藻 S c e n e d e s mu s和 C h l o r e l l a在氮含 量升高 时多不饱和脂肪酸 含量增 加 ；对于异养微生物 ，如真菌，不仅氮含量而且碳 含量也影响脂肪酸的生产。随着培养基中 C与 N 比 数的增加，Mo r t i e r e l l a r a ma n n i a n a菌体中的总脂含 量增加 ，因此也影响了其多不饱和脂肪酸 的含量。 此外，氮源种类也是一个重要 因素，M r a ma mn i a n a 在用硫酸铵为氮源时脂含量最高 J 。 含游离脂肪酸的培养基通常抑制微生物的其他 脂肪酸的合成 ，然而 ，Ok u mu r a和他的同事发现在 E u g l e n a g r a c i l i s的培养基中添加油酸及亚油酸可提 高它 的 P U F As的产量，尤其是花生四烯酸和 E P A。 有几种金属离子可促进脂或脂肪酸在微生物中 的合成 ， 在培养海洋微生物 时，天然海水是必需的， 除非基本培养基 中含有足够 的所有痕量元素。在不 含硅的硅藻培养基中，C y c l o t e l l a c r y p t i c a总的脂含 量有少许增加 ，但却抑制 了 P U F A s的合成，尤其是 DHA【 6 1 。 2 2 供氧 很显然在生物合成 P UF As 的途径微生物 的脱饱 和机制需要分子氧 ，可 以通过氧 的供给量来确定脂 肪酸的不饱和程度 ，在 甲藻 G y r o n i d i u m c o h n i i和 V i c e v e r s a 培养中增加氧 的供给可增加 E P A和 D HA 含量，E u g l e n a g r a c i l i s在厌氧的情况下生长只生成 饱和脂肪酸 。 2 - 3 光强与明暗循环 一 般来说，降低光照强度利于提高许多硅藻中的 E P A和DH A的形成与积累， 如 C y c l o t e U a me n a g h i n i a n a 、 N i t z c h i a c l o s t e r i u m 和 E u g l e n a g r a c i l i s 。然而 ，对 于 绿 藻C y c l o t e l l a mi n u t s s i ma 和 红 藻P o r p h y r i d i u m c r u e n t u m，光强 的影响刚好相反。应 当注意的一点 维普资讯 是，在许多光合藻类 中光 的缺乏将提高 f ,0 6脂肪酸 的合成而降低其 f,0 3脂肪酸的合成【 。 2 4 温度 嗜冷性微生物在低 于 2 0 的最适温度下不饱 和脂肪酸的含量要比中性微生物高，与此相似 ，嗜 热菌几乎不含有 P UF A s 。在大多数微生物的培养中 可观察到低温可增加 E P A和 DH A 的合成。B r o wn 和 R o s e认为，由于低温增加 了氧的溶解性，催化长 链不饱和脂肪酸脱饱和 的需氧的酶将会获得大量的 细胞间的分子氧 。另一方面，在微生物中与温度有 关 的 P U F As的合成是 一种对环 境 的适应 手段 。 S h i n me n等认为在生物合成途径中涉及到脱饱和及 延长链的酶的活性对温度极为敏感，因为在高温下 生物合成 E P A的路线 的中间物有积累的现象。 对 于生产率来说 ，尽管单 个微 生物在低温下 DH A 和 E P A 的含量有所提高，但它们 的生长速度 和生物量均有所下 降，因此总的产量反而会降低 。 2 5 菌龄 随着菌龄的增加，许多微生物都有以脂的形式 储存其能量的趋势，这种脂通常富含脂肪酸。一般 可 以认为在微生物中 P U F As 的改变遵循 S形 曲线 ， E P A 和 DH A 的浓度在对数生长期后期或稳定期的 初期达到最大值，然后在稳定期后期或衰老期逐渐 下 降 。 3微生物发酵法生产 E P A和 DH A的新进展 3 1 EP A 在某些细菌中发现了大量的 E P A， Y a z a wa 等检 测了 5 0 0 0株海洋微生物产 E P A的能力 ，分离到 8 8 株能产生 E P A的海洋细菌 ，其中一株专性好氧的细 菌 S C R C 8 1 3 2 。它在 2 5 下生长旺盛，4 下合成 最多的 E P A，在 P Y M 葡萄糖培养基 4培养 5 d ， E P A产量达 2 6 mg L，共占总脂肪酸的 4 0 ， 有趣的 是，这支菌株只产生 E P A而没有检测到有其他的多 不饱 和 脂肪酸 L 8 l 。 在真菌中发现的脂肪酸与其他生物中的相似 ， S h i mi z u等对 高山被孢霉 M a l p i n a等菌株作为 E P A 商业 生产 菌 的可行 性进 行 了研 究 ，他们 发现M a l p i n a生长在 1 2 C( 它的最适生长温度 为 2 0 2 8 ) 下可积累大量的 E P A ( 8 mg g干细胞、 ；S h i mi z u等还 发现被孢霉亚属的 A R A( 花生四烯酸) 生产菌生长在 低温下时在菌丝中特异性积累 E P A。采用无细胞抽 提物进行实验显示 这个 独特 的现象 ，是 由于参与 E P A合成的酶在低温下活化。采用 中间补料工艺和 变温培养可 以有效促进菌体产量和减少培养期，高 曩 品 技 山被孢霉2 0 1 7 和1 S 4 的 E P A 产量分 别达 到 4 9 0 mg L和 3 0 0 mg L。S h i mi z u曾将 1 S 4外源添加 亚麻籽油下在 1 2 培养 9 d ，菌丝体再在 1 2 老化 7 d ，结果 E P A产量达到 1 8 8 g L t 9 1 。由Me a d a c i d转 变 为 E P A 并不需要 1 2脱饱和酶 。1 S 4 突变株 Mu t 4 8由于缺乏1 2脱饱和活力，外源添加 Me a d a c i d将可 以大量产生 E P A而没有 AR A 的存在 。采 用含 3 亚麻籽油的培养基在 5 L罐 2 0 深层培养 Mu t 4 8 1 0 d ，E P A产量达到 1 2 几。虽然 Mu t 4 8 E P A 产量低于 S h i mi z u的结果 ，但是他们的生产率相差 无几 ，且 Mu t 4 8总脂中 AR A 的含量远低于 1 S 4的 含量 。由此也可 以看到 E P A的生物合成存在降温培 养和阻断突变型两条途径 。K e n d r i c k等对多支真菌 的脂肪酸作 了研究，发现 T h r a u s t o c h y t r i u m a l u e u m、 S c h i z o c h y t r i u m a g g r e g a t u m 和 S a p r o l e g n i a p a r a s i t i c a 3支菌 E P A含量较高 。Ma r t e k B i o s c i e n c e公司采 用 N i t z c h i z 异养培养生产 E P A。N a l b a 细胞浓度在 6 4 h内达到4 5 4 8 g L， E P A每天产量大约是 0 2 5 g L。 对于藻类 ，V a z h a p p i l l y等研究 了 2 0株微藻在 三角瓶中光 自养生产 E P A和 DH A 的潜能【 】 ” ，发现 E P A 产量最 高 的是 M s u b t e r r a n e u s ( 9 6 3 mg L ) ，P t r i c o mu t u m( 4 3 4 mg L) 和 C mi n u t e s s i ma( 3 6 7 mg L) ， 其 中 M s u b t e r r a n e u s 是生产 E P A的最好菌株，该藻 具有高生物量、 高生长速率、 高 E P A含量和无 DH A 的特点。P t r i c o mu t u m 的特 点是 E P A占总脂肪酸 比 例高，且能高细胞密度生长，从下游加工处理角度 看，该藻含 DH A极少 ， 不存在分离 D HA和 E P A的 潜在困难 。而紫球藻 P o r p h y r i d i u m c r u e n t u m随培养 条件不同其脂质组成变化较大 ， 主要含 AA和 E P A， 通过培养条件的控制既可用于 AA 的生产 ，又可用 于 E P A 的生产 1 1 。 3 2 DHA 迄今为止 DH A 生产菌有希望的来源主要集中 于破囊壶菌、 裂殖壶菌等海生真菌和海生异样微藻， 在它们体内 DHA 以甘油三脂形式存在 ，完全与鱼 油中 DH A 的存在形式一致。破囊壶菌和裂殖壶菌 均分离 自沿海岸海域，是有色素和具光刺激生长特 性 的海生真菌 。通常认为破囊壶菌在海洋珊瑚礁区 域生态系统中起着重要作用，它的菌体与单中心的 壶菌相似 ，但 大小和形状不一 ，营养体形成假根或 外质 网，游动孢子在孢子囊膜破裂后释 出 破囊壶 菌缺乏卵菌典型的鞭毛过渡区和细胞组成，同时在 原生质膜外覆盖有一层鳞片 。破囊壶菌与裂殖壶菌 的主要 区别 在于裂殖壶菌营养细胞进行 连续二均 分裂【 。B a j p a i等发现破囊壶菌 T h r a u s t o c h y t r i u m 维普资讯 艮 品 技 a r u e u m A T cc 3 4 3 0 4总脂肪酸中 5 0 均为 D HA，在 含 2 5 淀粉的培养基上光照培养 ，其 D HA产量达 到 5 1 l mg L。I i d a等对培养基进行了优化后细胞产 量达到 5 7 g L l 1 引 ， L i Z u y i 等则发现 T h r a u s t o c h y t r i u m a r u e u m A T C C 2 8 2 1 0在培养基中有更分散的形态， 在 初步优化培养基条件后 ，A T CC 2 8 2 1 0最高 DH A产 量达到 8 5 0 mg L 1 钔 。 S i n g h等对发酵培养基和条件进 行优化后，结果 A T C C 2 8 2 1 0的 5 d培养生物量和 D HA产量达到 1 0 4 g L和 1 0 1 l g L，他们还 比较 了 T h r a u s t o c h y t r i u r n s p A T CC2 0 8 9 0、2 0 8 9 1 、2 0 8 9 2和 裂殖 壶菌 S c h i z o c h y t r i u m s p A T C C 2 0 8 8 8 、2 0 8 8 9的 产量与脂肪酸组成，S c h i z o c h y t r i u m s p 生物量高但 D HA含量相当低，T h r a u s t o c h y t r i u m s p A T C C 2 0 8 9 2 具有高含量的 D HA 而其它多不饱和脂肪酸的含量 很低 ， 通过对培养基和培养条件的优化 ， A T C C 2 0 8 9 2 D HA产量达到 7 0 7 4 mg L 。与 S i n g h等的结论相 反，N a k a h a r a等从 Y a p 岛珊瑚礁区域分出的一株 S c h i z o c h y t r i u r n s p S R 2 1无论是 DH A产量或生产率 都是最 高 的 ，5 d 发酵 生物 量和 DH A 产 量达到 5 9 2 g ， L和 1 5 5 g L l J 。 对于海藻这一有希望 的 D HA 生产来源 ，根据 筛选结果，普遍认为用于生产 D HA 的最好藻种是 异养海藻 C r y p t h e c o d i n i u m c o h n i i ，该藻种最大的优 点就是异养生长好。日本川 I 崎公司上原健一等筛选 了 A T C C( Ar n e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n ) 保存的 隐 甲藻 C r y p t h e c o d i n i u m c o h n i i 的多个藻种，结果 ， A T C C3 0 0 2 1的 D HA含量最高，通过培养基组成的 优化，D HA的产量达到 1 7 5 g L 1 7 】 。华南理工大学食 品与生物工程学院姜悦与王菊芳博士对 A T C C 3 0 5 5 6 进行 了研究 ，优化培养基和发酵条件后藻生物量和 DH A产量分别达到 1 0 7 8 g L和 1 2 0 5 g L 1 剐 。 4结 束语 近年来利用微生物发酵法生产 多不饱和脂肪酸 E P A 和 DH A 的研究已经取得了很大的进展，国外 已有商业生产的成功先例，我国 目前这方面 的工作 则刚起步，所进行的工作主要集中在以下几个方面： ( 1 ) 从海洋生物群 中继续筛选 E P A和DH A含量高的， 且易于分离提纯的海洋真菌 、细菌和微藻；( 2 ) 对现 有的几种高产 E P A和 DH A 的微生物继续进行诱变 等改造 以提高其生产能力，并对现有发酵工艺和反 应器进行改进；( 3 ) 建立简单高效的 DH A和 E P A浓 缩提纯技术 。 随着基因工程等现代生物技术的发展 ， 对海洋微生物进行基因改造、筛选，发酵工艺技术 下游分离提纯技术 的改进，作为利用鱼油生产 E P A 和 D HA 的替代方法的微生物发酵法生产 E P A 和 D HA也将获得更大的进步。 参考文献： 1 】 Dy e r b e r g J Nu t R e v ， 1 9 8 6 ， 4 4 ( 4 ) ： 1 2 5 2 】 Ac k ma n R G S M， S t a n b y M E Nu t r i t i o n a l E v a l u a t i o n o f Lo n g c h a i n F a t t y Ac i ds i n Fi s h Oi l Lo n d o n ： Ac a d e mi c P r e s s ， 1 9 8 2 ： 2 5 3 】 徐天宇 1 用生物技术生产二十二碳五烯酸和二十二 碳六烯酸 食品与发酵工业。 1 9 9 5 ， 2 1 ( 1 ) ： 5 6 6 5 4 】 S t r y e r B i o c h e mi s t r y N e w Y o r k ： W H F r e e ma n a n d C o ， 1 9 8 8 ： 2 8 3 3 1 2 5 Y o k o c h i ， S u z u k i O Y a k a g a k u ， 1 9 8 7 ， 3 6 ( 3 ) ： 4 1 3 6 Ka mi s a k a ，K i k u t s u g i ，Y o k o c h i ，N a k a h a r a ， S u z u k i O Y u k a g a k u ， 1 9 8 8 ， 3 7 ( 5 ) ： 3 4 4 7 】 Or c u t t ， P a t t e r s o n L i p i d s ， 1 9 7 4 ， 9 ( 1 2 ) ： 1 0 0 0 【 8 1 Yz a wa k ， Ar a k i k J B i o c h e m， 1 9 8 8 ， 1 0 3 ( 1 ) ： 5 7 9 】 S h i mi z u S ， Ka wa s h i ma H Ap p l Mi c r o b i a l B i o t e c h n o l ， 1 9 8 9 ， 3 2： 1 - 4 1 0 】 K e n d r i c h ， C R a l e d g e L i p i d s ， 1 9 9 2 ， 2 7 ( 1 ) ： 1 5 2 0 1 1 】 V a z h a p p i l l y R ，C h e n F J Am Oi l C h e m S o c i e t y ， 1 9 9 8 ， 7 5 4： 3 9 3 3 9 7 1 2 】 We e t e J D， Ki m H， Ga n d h i S R L i p i d s and Ul t r a s t r u c t u r e o f T h r an s t o c h y t r i u m s p ATCC2 61 8 5 Li p i d s ， 1 9 9 7 ， 3 2 ( 8 ) ： 8 3 9 8 4