微生物发酵法生产DHA的研究.pdf

1 2 8 2 0 0 5 , V o 1 2 6 , N o 3 髑着 工艺技术 微生物发酵法生产 D H A 的研究 杜 冰 ，刘长海 ，姚汝华z ( 1 仲恺农业技术学院食品系，广东 广州 5 1 0 2 2 5 ； 2 华南理工大学食品与生物工程学院，广东 广州 5 1 0 6 4 0 ) 摘要：D H A是一种人体必需多不饱和脂肪酸。对人体健康有重要意义，微生物发酵法生产 D HA具有稳定性好、 易于分离纯化和工业化等优点 ，是近年来研究的热点。本文通过对破囊壶菌 A T C C 3 4 3 0 4等四株菌的发酵液 的分 析，发现 A T C C 3 4 3 0 4易于培养且 D H A含量高。对 A T C C 3 4 3 0 4 的发酵培养基组分和发酵条件进行进一步研究后得 出。在 以淀粉为碳源的培养基中，2 8 C 1 7 0 r mi n 摇床光照培养 6 d 。D H A含量达 3 2 0 1 m g L。 关键词 ：微 生物 ；二十 二碳 六烯酸 ；破 囊壶菌 ；发酵 s t u d yo f DHAP r o d u c fi o nb yMi c r o o r g a n i s m F e r me n t a t i o n DU Bi n g ， L I U Ch a n g h a i ， YAO Ru h u a ( 1 De p a r t me n t o f F o o d S e i e n c e ， Z h o n g k m Ag r i c u l t u r a l T e c h n o l o g y Co l l e g e ， Gu a n g z h o u 5 1 0 2 2 5 ， C h i n a ；2 C o ll e g e o f F o o d E n g i n e e r i n g a n d Bi o t e c hno l o g y ， S o u t h C h i n a Un i v e i t y o f T e c hno l o g y ， G u ang z h o u 5 1 0 6 4 0 ， C h i n a ) Ab s t r a c t ：DHA i s o n e n d o f e s s e n ti a l p ol y u n s a t u r a t e d f a t r y a c i d s a n d i t h a s i mp o r t a n t e ffe c t o n b o d y h e a l t h Th e p r o d u c t i o n o f DHA b y mi c r o o r g a ni s m f e r me n t a t i o n h as man y s u p e r i o riti e s s u c h as g o o d s tab i l i t y。 b e i n g p r o n e t o s e p a r a ti o n ， p u rific a ti o n an di n d u s t r i a l i z a tio n I t Was a r e s e a r c hh o t s po t i n r e c e n t y e a r s Byan aly z i n gtherm e n tati o np r o d u c t o f theT h r a u s t o c h y t r i u m a u r e u mATCC3 4 3 0 4ando the r f o u r s U aln ， i t s h o we dtha t theATCC3 4 3 0 4c o u l dbe c u l t u r e dmo re e a s i l yan dthec o n t e n t o f DHA Was h i g h W h e nthec o mp o s i ti o no f me d i u m an dthef e rm e n tati o nc o n d i ti o no fT h r a u s to c h y t r i u ma u r e u m ATCC3 4 3 O 4we l l f u r t h e r s t u d i ed mo re， i t Was f o u n dtha t wh e ntheATCC3 4 3 0 4Was c u l ti v a t e di ntheme d i u m i nwh i c hthe s t a r c hWas u s e das c a r b o n s o u r c e a n d a t 2 8 C wi th 1 7 0 r mi n f o r s i x d a y s ， the y i e l d o fDHA Was h i g h e s t , 3 2 0 1 mg L Ke y wo r ds ：mi c r o o r g a n i s m； DHA；Th r a u s t o c h y t r i u m a u r e u m：f e rm e n t a t i o n 中图分类号：Q 5 4 6 文献标识码 ：A 文章编号：1 0 0 2 6 6 3 0 ( 2 0 0 5 ) 0 3 0 1 2 8 0 3 多价不饱和脂肪酸( p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s P U F A ) 是指含有两个或两个以上双键，且碳链长为 l 6 2 2 个碳 原子的直链脂肪酸。它主要包括二十碳五烯酸( E P A) ， 二十二碳六烯酸( DHA) 等，具有降血脂、抗血栓和抗炎 等生理作用，是很好的医药和营养食品成分，尤其是 DHA，目前广泛受到医疗界和食品界的关注 1 , 2 1 。目前 DHA的商业来源是从深海鱼油中进行分离，但 由于这 种海洋资源十分有限，而且鱼油中 DHA的含量随鱼的 种类 、季节 、地理位 置等变化而变化 ，不能满足社会 的需求 。因此， DH A生产研究逐渐向利用生物技术合 成方向发展。利用生物技术合成 DHA具有周期短，脂 肪酸构成简单及有较大的生产潜力等优点，而且不受原 料的限制，微生物发酵法生产的 DHA不具有从鱼油中 提纯的DHA的鱼腥味，更有利于 DHA的应用 ，日本 、 美国等纷纷对发酵法生产 D HA进行了研究【 4 】 ，而国内在 这一领域的研究则少见报道。本文就 DHA高产菌株的 选育及发酵培养基的选择等作了一系列的研究，旨在为 生物技术合成 DHA奠定一定的基础。 1 材料 与方法 1 1 菌种 海洋小球藻( c m i n u t i s s i m a ) ，等鞭金藻( I s o c h r y s i s S P)， 由 中 国 科 学 院 南 海 海 洋 所 提 供 ， 隐 甲 藻 A T C C 5 0 0 5 l ( C r y p t h e c o d i n i u m c o h n i i ) ，由香港大学陈峰 博士提供，破囊壶菌 ATC C3 4 3 0 4 ( T h r a u s t o c h y t r i u m a u r e u m) ，购 自A T C C ( A me r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n ) 。 收稿 日期：2 0 0 4 0 2 2 6 基金项 目：国家 “ 九五”科技攻关项 目( 9 6 - C 0 3 - 0 l - 0 4 ) 作者简介 ：杜冰( 1 9 7 3 - ) ，男，工程 师，研 究方 向为生物工程和发酵食品 。 维普资讯 工艺技术 2 0 0 5 , V o 1 2 6 , N o 3 1 2 9 1 2 培养基 1 2 1 固体斜面培养基 谷氨酸钠 2 g L，维生素B- 1 0 u g L，维生素 B1 2 1 p g L，葡萄糖 2 0 g L，酵母粉 2 g L，琼脂 2 0 g L，用人造海水配制。 1 2 I 2 液体培养基 谷氨酸钠 2 g L ，维生素B l 1 0 1 z g L ， 维生素 B1 2 1 u g L，葡萄糖 2 0 g L，酵母粉 2 g L，用人 造 海 水 配 制 。 1 2 3 P o r p h y r i d i u m 培养基【 。 1 3 方法 1 3 1 发酵条件 海洋小球藻和等鞭金藻在人造海水中光照下进行 自 养发酵，隐甲藻AT C C 5 0 0 5 1 在 P o r p h y r i d i u m培养基中 以5 的接种量接种，在 2 5 、1 5 0 r mi n摇床培养 4 d 。 破囊壶菌AT C C 3 4 3 0 4在液体培养基中以5 的接种量接 种 ，在 2 8 、1 7 0 r mi n摇床光照培养 6 d。 1 3 2 菌体油脂的提取 S o x h l e t 提取法I 。 1 3 3 脂肪酸不饱和度测定 用尤布里 瓦列尔碘试剂 法 【 7 1 。 1 3 I 4 DH A含量的检测 采用气相色谱法测定I 。 1 3 - 5 培养基的选择 分别采用 2 葡萄糖 + 0 2 酵 母粉 ； 2 玉米淀粉 + 0 2 酵母粉： 2 糊精 + 0 2 酵母粉： 2 麦芽糖 + 0 2 酵母粉 ； 2 蔗糖 + 0 2 酵母粉，五种培养基在 2 8 下 1 7 0 r mi n 振荡培养 6 d ，取样检测菌体 中的油脂及 DHA 的含量 。 1 3 6 发酵条件的确定用 H C I 和 N a O H调节培养基的 初始 p H，使之在4 0 8 0之间取不同值，在不同温度下 发酵，接种后每隔 2 4 h 检测菌体中油脂及 DHA的含量， 从而确定发酵液初始 p H、最适发酵温度和发酵时间。 2 结果与讨论 2 1 不同菌种的发酵结果 采用方法中的培养方法对 4支不同的菌株进行发酵 培养后，测定菌体 内的 DHA含量，结果如表 1 所示。 表 1 不同菌体发酵产D H 的比较 1 j日 b I e 1 C o mp a ri s o n o f DHA p r o d u c t i o n b y d i ff e r e n t i n i t ia l s t r a in s 从表 1 可以看出，隐甲藻A T C C S 0 0 5 1 D HA产量低， 而且对生长温度要求 比较严格 ，难 以培养 ，故不适合 用作 DHA的生产菌，其它三株菌的DHA产量均较高， 但海洋小球藻和等鞭金藻均为 自养型生物，生长较慢， 难 于 调 控 培 养 ， 也 不 适 于 发 酵 生 产 ， 破 囊 壶 菌 AT C C3 4 3 0 4 DH A含量高而且易于培养，故选破囊壶菌 AT C C 3 4 3 0 4为出发菌株进行发酵研究，以提高其DHA 的 产 量 。 2 2 发酵培养基的确定 以破囊壶菌 AT C C 3 4 3 0 4为出发菌株，采用方法中 的 5种培养基发酵后，检测菌体中 DHA 的产量，结果 见表2 ，结果表明培养基中的菌体 DH A含量最高，但 在实验中可观察到在培养基中，即在以淀粉为碳源的 培养基中菌体生长速度最快，而且经检测可得在其中菌 体得率最高，而且从工业生产的角度 出发，淀粉是最 容 易获得，而且是最便宜 的原料，因此可确定淀粉为 破囊壶菌 AT C C3 4 3 0 4 发酵产 DH A的最适碳源。 表 2 碳源对 A T C C3 4 3 0 4生产 DH A的影响 T a b le 2 E ff e c t s o f v a r i o u s c a r b o n s o u r c e o n p r od u c t i o n b y A T CC3 4 3 0 4 2 3 发酵温度的确定 分别在 2 0、2 5 、2 8 、3 0、3 5 不同温度下进行发 酵，发酵后测菌体 中的DHA的含量，结果如表 3所示。 表 3 温 度对 A TC C3 4 3 0 4生产 DHA的影响 T a b l e 3 E ff e c t s o f t e mp e r a t u r e o n DH A p r od u ctio n b y AT CC3 4 3 0 4 温度( ) 2 0 3 2 2 7 4 7 58 0 2 5 4 4 3 06 2 6 9 5 9 2 8 5 3 3l 95 6 0 28 3 0 5 、 4 3l 0 7 5 7 5 4 3 5 4 1 2 2 6 3 5 5 2 0 菌体干重t g L ) DHA含量( mg L ) D H A i( m #g 菌体干重) 从表 3可以看出，温度愈低，单位菌体的DHA产 量愈高 ，一方面，由于低温增加 了氧的溶解性，催化 长链不饱和脂肪酸脱饱和的需氧的酶将会获得大量的细 胞间的分子氧 ，另一方面，在微生物 中与温度相关 的 多不饱和脂肪酸的合成是一种微 生物对环境的适应手 段 ，微生物通过增加生物膜脂肪酸的不饱和程度提高膜 的流动性来抵抗低温环境。故低温有利于 ATC C3 4 3 0 4 DHA的合成 ，但在低温下菌体生长缓慢，菌体在低于 2 8 时生物量过低 ，所 以在低温下尽管单位菌体中的 DHA产量高但不适于生产，而温度为 3 0 ， 虽然菌体量 较高， 但 DH A含量却降低， 温度继续升高， 菌体量和DHA 含量都降低 。故发酵温度取 2 8 最为适宜。 2 4 发酵初始 p H的确定 选用培养基 为发酵培养基，调节初始 p H值为 维普资讯 1 3 0 2 o o 5 V o L 2 6 , N o 3 食 品 香 峭譬 工艺技术 4 0 、5 0、6 0 、7 0 、8 0进行发酵，并于不同时间取 样测菌体中的 DHA 的含量，结果如表 4所示。 表 4 初始 p H对 A TC C3 4 3 0 4生产 D HA的影响 T a b le 4 E ff e c t s o f i n it i a l p H o n DH A p r o d u c t i o n b y A T CC3 4 3 0 4 初始 p H 菌体干重( g r L ) D HA含量( rag L ) 从 表 4 可 以看 出 ，随 着 初 始 P H 值 的 增 加 ， A T C C 3 4 3 0 4菌体中的D H A的含量增加，到6 0时达到最 大值，但大于 6 0后开始下降，AT C C 3 4 3 0 4的生物量随 初始p H值的增加而增加，在大于 6 0后尽管生物量仍然 增加，但DHA 的含量快速下降，所以6 0为最适发酵 初 始 PH 值 。 2 5 发酵时间对菌体产生 DH A 的影响 采用上述 优化的工艺条件进行发酵 ，每天取样 ， 测定菌体干重和 DHA 含量，如表 5所示。 表5 A T C C 3 4 3 0 4在不同培养时间时的 D H A含量 T a b l e 5 D HA c o n t e n t i n d iff e r e n t c u l t u r e t i me b y A T CC 3 4 3 0 4 些鲞 ! 兰 ! 菌体干重( g ， L )0 2 1 1 2 5 3 8 4 9 5 4 5 0 DH A含量( r n g L )0 3 0 2 7 0 1 1 0 9 3 2 1 0 5 3 2 0 1 3 0 4 5 从表5可以看出，AT C C 3 4 3 0 4在对数生长期的后期 开始大量合成 DHA，并在平衡期达到最大值，在衰亡 期，DHA 的含量随菌体量的下降而下降。 由此可 以确 世界食 用油供应过剩 定AT C C 3 4 3 0 4发酵产DHA的时间为6 d 。 破囊壶菌AT C C 3 4 3 0 4具有很好的生产DH A的潜在 能力，利用代谢调控及基 因工程等手段进一步提高其 DHA的产量，有希望成为微生物发酵生产 DHA的生产 菌株 ，开发前 景十分广 阔。 参 考 文献 ： Ho r r o b i n DF C l i n i c a l u s e s o f e s s e n t i al f a t t y a c i d s M E d e n P r e s s I n c ，1 9 8 2 3 3 6 Dy e r b e r g n 一 3 p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s J J N u t r i t i o n R e v i e w ， 1 9 8 6 ， 4 4 ( 4 ) ： 1 2 5 1 3 8 S h i mi z u S ， Ka wa s h i ma H P r o d u c ti o n o f e i c o s a p e n t a e n o i c a c i d b y Mo r t i e r e l l a f u n g i 【 J 】 Ap p l Mi c r o b i al B i o t e c h n o l ， 1 9 8 9 ， 3 2 ： 1 - 4 B a j p a i P ， P r a mo d K B Ow e n P W P r o d u c t i o n o f d o c o s a h e x a e n o i c a c i d b y T h r a u s t o c h y t r i u m a u mu m J Ap p l M i c r o b i al Bi o t e c h n o l o g y ，1 9 91 ， 3 5 ： 7 0 6 - 71 0 姜悦 利用隐甲藻C r y t h e c o d i n i u m c o h n i i 生产 D H A的研 究【 C 】 华南理工大学博士学位论文， 1 9 9 8 3 3 3 8 前田安彦 实用食品分析方法 【 M】 长