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微生物产赖氨酸的研究进展 收稿日期：2009-09-09 基金项目：黑龙江省科技厅项目 （GA07B401-5 ） 作者简介：刘晓飞 （1980- ） ，女，博士研究生，研究方向为农业微生物。E-mail: liuxiaofei72163. com * 通讯作者：高学军，教授，博士生导师，研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail: gaoxj5390sina. com 刘晓飞1，高学军1*，刘营2，敖金霞2，王青竹1 （1. 乳品科学教育部重点实验室，东北农业大学，哈尔滨150030；2. 东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，哈尔滨150030） 摘要：赖氨酸是人和动物营养的 9 种必需氨基酸中的第一必需氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料等领 域。发酵法是目前生产赖氨酸最主要的方法。文章从赖氨酸的生产现状、生物合成途径、代谢调控，育种等方面 阐述了微生物生产赖氨酸的研究进展。 关键词：赖氨酸；发酵；生物合成；代谢调控 中图分类号：Q93-91文献标志码：A文章编号：1005-9369 （2010 ） 01015704 Research progress on microbial production of Lysine/LIU Xiaofei1, GAO Xuejun1, LIU Ying2, AO Jinxia2, WANG Qingzhu1(1. Key Laboratory of Dairy Sciences, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Research Center of life Sciences and Biotechnique, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China) Abstract:As one of the essential amino acids for human beings and animals, Lysine is widely used in many fields, such as pharmaceutical, food and forage. The fermention is the frequently used method of Lysine production at present. This paper stated the research evolution focused on aspects of production situation, biosynthetic pathways, metabolic controland regulation and breeding of Lysine. Key words:Lysine; fermentation; biosynthesis; metabolic controland regulation 赖氨酸 （Lysine ） 的化学名称为 2，6-二氨基己 酸，有 L-型 （左旋） 、D-型 （右旋） 和 DL 型 （消旋） 三种旋学异构体。人类和动物可吸收利用的只有 L-型。它对调节体内代谢平衡、提高体内对谷类 蛋白质的吸收、改善人类膳食营养和动物营养、 促进生长发育均有重要作用。饲料中添加赖氨酸 对单胃动物极其重要，如豆粕中添加适量的赖氨 酸，可以大大提高蛋白质的利用率，促进禽畜生 长。赖氨酸还决定断奶仔猪体内蛋白质合成、沉 积以及其他氨基酸的利用率，赖氨酸转化为体蛋 白的效率高达 86%1。赖氨酸应用范围较广目前， 有 90%的赖氨酸应用于饲料工业，尤其是 2003 年 以后，我国已成为全球最大的赖氨酸生产国。本文 从赖氨酸生产现状、生物合成途径、发酵调节机 制、微生物应用等方面综述了微生物产赖氨酸的研 究现状及应用前景。 1赖氨酸生产现状 L-赖氨酸最初是从蛋白质水解物中分离得到的， 蛋白质水解法一般以动物血粉为原料，此法特点是 工艺简单，但原料来源有限，仅适合小规模生产。 后又出现了化学合成法、酶法，使用的合成法主要 有荷兰的 DMS （Dutch State Mijinen ） 法和日本的东丽 法，此法最大缺点是使用剧毒原料光气，可能残留 催化剂，产品安全性差，存在严重的环保问题2。 1960 年，日木首先采用微生物发酵法生产。微生物 发酵生产氨基酸是人为地解除氨基酸生物合成的代 谢控制机制，使其积累大量所需氨基酸。氨基酸的 L-型立体专一性决定了发酵法生产氨基酸较化学合 成的工艺更简单、快捷。我国于 20 世纪 60 年代中 第 41 卷 第 1 期东北农业大学学报41(1): 157160 2010 年 1 月Journal of Northeast Agricultural UniversityJan. 2010 期开始进行赖氨酸菌株选育和发酵的研究，但因产 量较低难以工业化。直到 70 年代末 80 年代初世界 赖氨酸实现工业化后我国研究才取得突破。目前， 世界约 2/3 的赖氨酸企业采用发酵法生产，生产的 为 L-型赖氨酸，生产工艺已基本成熟。近年来， 赖氨酸的需求逐年增加，全世界每年大概 80 万 t 赖氨酸通过发酵生产的方式获得。 用于工业上发酵生产赖氨酸的菌株主要是棒状 杆菌和短杆菌等细的变异株，棒状杆菌具有极高的 经济价值3，其中谷氨酸棒状杆菌应用最为广泛4。 此外，赖氨酸生产还有应用大肠杆菌5、黄色短杆 菌6、酿酒酵母7、乳酸发酵短杆菌8、假丝酵母9 等的报道。 生产赖氨酸的微生物主要有四类：野生型、营 养突变型、调节突变型和营养调节突变型。工业上 通过优化发酵菌种 （诱变和基因工程手段 ） 和改变发 酵条件 （搅拌速度、pH、溶氧、温度和 CO2） 来提高 赖氨酸产量。获得高产微生物菌株的方法主要有传 统诱变方法 （紫外线、X 射线、氮芥和亚硝基酯等 ） 、 原生质体融合和基因工程方法等。据报道，经过诱 变菌株产生的赖氨酸提高 40%50%。诱变菌株以价 格低廉的碳源为发酵原料，如各种淀粉水解糖、蜜 糖、醋酸和乙醇等，发酵生产赖氨酸，通过分离、 浓缩、蒸发、结晶、干燥生产工艺获得饲料级赖氨 酸、再精制可得到食品级、医药级产品10。 2赖氨酸的生物合成途径 2.1天冬氨酸途径 天冬氨酸途径又称二氨基庚二酸途径，此途径 多存在细菌、绿藻、原虫和高等植物中，以天冬 氨酸为起始物质，还可以合成苏氨酸、蛋氨酸和 异亮氨酸11。 2.2-氨基己二酸途径 -氨基己二酸途径存在于酵母和霉菌中。酵母 主要是酿酒酵母 （Saccharomyces cerevisia ） ，霉菌主 要是粗糙脉孢菌 （Neurspora crassa ） 。 3赖氨酸的代谢调控与育种 3.1添加结构类似物 抗类似物突变株也称为代谢拮抗无抗性突变 株。选育抗类似物突变株，是目前代谢控制发酵育 种的主流。选育抗类似物突变株，因为代谢调节可 被遗传性地解除，在发酵时可不再受培养基成分的 影响，代谢较为稳定。另外，抗类似物突变株还具 有不易发生回复突变的优点。添加赖氨酸的结构类 似物是采用切断或减弱支路代谢的方法来增加赖氨 酸的积累。由于限制高丝氨酸 （Homaserine，Hom ） 的补给量，使苏氨酸 （Threonine，Thr ）和蛋氨酸 （Methionine，Met ） 的生成有限，从而解除了 Thr 和 Lys 对天冬氨酸激酶 （Aspartate Kinase，AK ） 的协同 反馈抑制，使 Lys 得以积累。s- （-氨基乙基 ） L-半 胱氨酸 （S- （-aminoethyl ） -L-cysteine hydrochloride， AEC ） 是生产赖氨酸常用的结构类似物。 Aida 等从日本土壤中分离得到的野生型枯草芽 孢杆菌产赖氨酸 2.5 g L-112。Chaudhurl 等使用从印 度土壤中分离得到的枯草芽孢杆菌 13，依照 Adelberg 的方法加入浓度为 300 g mL-1N-甲基- N-硝基-N-亚硝基胍 14 （N-methyl-N-nitro-N- nitrosoguanidine （carcinogen，mutagen ），MNNG ），在 培养基中加入20 mmol L-1AEC 后得到的突变株产赖 氨酸 16 g L-1，再经 60 s 的紫外线照射后的突变株产 赖氨酸 21 g L-1。Sands 等使用乳酸杆菌经过 AEC 四 次诱变，原始菌株的赖氨酸产量不足 1 g mL-1， 而突变株赖氨酸产量达到 72 g mL-115。张伟国等 以黄色短杆菌 （Brevibacterium flavum ） ATCC14067 出发，经过亚硝基胍 （Nitrosoguanidine，NTG ） 、硫 酸二乙酯 （Diethyl Sulfate，DES ） 逐级诱变处理，用 AEC、磺胺胍 （Sulfaguanidine，SG ） 等氨基酸结构类 似物及琥珀酸为唯一碳源平板定向育种，获得 1 株 L-赖氨酸高产菌，L-赖氨酸盐酸盐产量达 7782 g L-116。Jose 等以酿酒酵母为出发菌株，加入赖氨 酸的结构类似物 AEC，以脯氨酸为氮源，得到的突 变株产赖氨酸是野生株的 37 倍17。 3.2改变膜的通透性 改变细胞膜透性选育赖氨酸高产菌株是行之有 效的选育途径，赖氨酸是在菌体内合成后，通过细 胞膜渗透到发酵液中的。如果能够改变细胞膜的通 透性，一方面可以使产物易于提取，另一方面可以 降低产物在菌体中浓度，使产物不能引起反馈抑制 或阻遏作用。 齐秀兰等利用 L-赖氨酸产生菌钝齿棒杆菌 （Corynebacterium crenatum ） D60-95 经紫外线诱变， 使用七叶苷筛选抗性菌株，获得高产稳定菌株 E0.9-37，L-赖氨酸产量为 82.0 g L-1，较出发株提 158东北农业大学学报第 41 卷 高 20.6%。通过优化发酵培养基使菌株 E0.9-37 L- 赖氨酸产量高达 111.0 g L-1，较出发菌株提高了 63.2%18。试验证明，七叶苷对于改善细胞的通透 性有一定作用。潘中明等以乳酸发酵短杆菌 AL039 为出发株，经亚硝基胍诱变，筛选到一株氟丙酮酸 敏感型突变株 FP094，其赖氨酸产量比出发菌株提 高 37.5%，当添加生物素的量在 200500 g L-1时， 可以明显地提高赖氨酸的产量和转化率，证明高浓 度的生物素对乳酸发酵短杆菌高产赖氨酸是有利 的，因为添加过量生物素会导致生物细胞膜中更多 的磷脂分子合成，限制了谷氨酸和天冬氨酸向胞外 的分泌，从而使细胞内的谷氨酸对谷氨酸脱氢酶等 产生反馈抑制，迫使代谢流向合成天冬氨酸的方向 进行，天冬氨酸进而合成赖氨酸19。 3.3增加前体物 增加天冬氨酸浓度，天冬氨酸激酶与底物的亲 和力协同性增大，能够抵消变构抑制剂的影响，使 前体物 （丙酮酸、草酰乙酸、天冬氨酸等 ） 充分地用 于合成赖氨酸。 从葡萄糖形成赖氨酸的过程中，依赖于天冬氨 酸生成的量。天冬氨酸是乳酸发酵短杆菌生产赖氨 酸的前体物。赖氨酸是从丙酮酸和天冬氨酸反应转 变形成的。丙酮酸激酶在变构调控作用下，化醇丙 酮酸不可逆变地转化成丙酮酸20。Osaka 等从乳酸 发酵短杆菌 AJ3990 出发，诱发得到 -氟丙酮酸钠 （EP ） -敏感突变株 AJ11204。AJ11204 以葡萄糖为 碳源，发酵在 32 进行，用加入气态氨调节 pH 在 6.5，同时补充氧保持在 0.010.10 个大气压21。在 过量生物素存在的条件下，发酵 48 h 积累赖氨酸 70 g L-1，葡萄糖转化率为 50%。EP-敏感突变株的 丙酮酸脱氢酶活性减弱，为出发菌株的 27%，增加 了丙酮酸在细胞内的浓度，大量积累赖氨酸的前体 物天冬氨酸，从而得到高产赖氨酸的菌株。 Shvinka 等指出赖氨酸合成中间产物草酰乙 酸可由三羧酸循环或磷酸烯醇丙酮酸羧化途径获 得22。乙酰 CoA 促进磷酸烯醇式丙酮酸羧化作用， 添加醋酸可以增加乙酰 CoA 的生成，促进磷酸烯 醇式丙酮酸羧化反应23。此外，添加醋酸可以诱导 乙醛酸支路，可以补充草酰乙酸及三羧酸途径的中 间产物，从而促进菌体生长和赖氨酸合成24。潘中 明等通过试验验证，醋酸钙加量在 2 %左右对赖氨 酸发酵最为理想19。 3.4原生质体融合 原生质体融合技术是微生物遗传育种上一项重 要技术，它具有遗传信息传递量大，不受亲缘关系的 影响，可有目的地选择亲株以选育理想的融合株，便 于操作等优点，在遗传育种中具有广阔的应用前景。 楼纯菊等进行了提高产朊假丝酵母体内赖氨酸 含量的研究。通过蜗牛酶和溶壁酶制备产朊假丝酵 母原生质体，将形成的原生质体紫外诱变处理来提 高赖氨酸产量，所得突变株的赖氨酸含量达到 8.46 g L-1，比对照株高 41%25。 3.5构建基因工程菌 利用基因工程技术构建氨基酸工程菌株，把依 靠诱变技术取得的优良特性通过重组 DNA 技术加 以组合和应用。 Anastassiadis 通过扩增谷氨酸棒杆菌和黄色短 杆菌代谢关键酶、整合 DNA 染色体或插入编码基 因等来提高赖氨酸的产量26。Ohnishi 等研究了谷氨 酸棒杆菌产赖氨酸菌株和野生株的末端代谢途径、 碳源流向、代谢互锁的相关基因。将野生株中的高 丝氨酸脱氢酶和天冬氨酸激酶分别与丙氨酸突变株 中的高丝氨酸脱氢酶和亮氨酸突变株中的天冬氨酸 激酶等位互换，分别得到了产赖氨酸 8 和 55 g L-1 的菌株；将以上两个突变株在野生株中重新构建， 产赖氨酸 75 g L-1；将丝氨酸突变株中的丙酮酸羧 化酶转入到野生株中，仅发酵 27 h 就得到赖氨酸 80 g L-127。 赵凯等以北京棒杆菌为研究对象，通过四轮基 因组重排成功选育出了 5 株遗传稳定的高产赖氨 酸菌株，其中 1 株重排菌株赖氨酸产量达到 16.95 g L-1，比原始菌株的赖氨酸产量提高了 37.14%， 比亲本菌株赖氨酸产量提高了 17.46%31.19%28。 4微生物生产赖氨酸的前景展望 中国赖氨酸产业起步于 20 世纪 90 年代初，当 时赖氨酸总生产能力为每年 1 万 t。近年来，随着 我国赖氨酸产能量的高速增长，从 2001 年每年不 足 5 万 t 增长到 2005 年国内赖氨酸总供给量约每 年 20 万 t；2006 年，赖氨酸产量已超过 32 万 t； 2007 年，国内赖氨酸的总产量约每年 40 万 t，成 为世界最大的赖氨酸生产国。 2006年，进口赖氨酸的平均价格为13.30元 kg 1； 2007年，国内进口赖氨酸的均价约14.30 元 kg1，同 刘晓飞等：微生物产赖氨酸的研究进展第 1 期159 比上涨了约 6.7%；国产赖氨酸均价约 14.40 元 kg1， 同比上涨约 10%。虽然赖氨酸价格的涨幅较大，但 生产厂家的利润并未因此增加，其主要原因是原料 成本和物流费用的增加。随着国产赖氨酸技术上的 改进，产氨基酸优良菌种的筛选和分子育种，通过 不断发掘新的菌种和改良现有的菌种，使产量增 加、成本降低、质量改善、功能增强、酶活性提 高，彻底实现赖氨酸国产化。使用微生物发酵赖氨 酸有方便、快捷和高效等特点，具有广泛的市场空 间和经济前景。 参考文献 1 罗钧秋, 陈代文 赖氨酸对蛋白质代谢的影响及其可能调控机 制J 饲料工业, 2006, 27(16): 40-43. 2 夏彬 L-赖氨酸工业化生产进展综述J 川化, 2005(1): 9-12. 3 Hermann T. 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