微生物发酵生产番茄红素的研究进展.pdf

生物技术通报 B I O T E C H N O L O G Y B U L L E T I N 技术与方法 2 0 0 6年第4期 收稿日期:2 0 0 6 - 0 3 - 0 7 作者简介: 张丽靖(1 9 7 9 -) , 女, 讲师, 主要从事微生物发酵研究,E - m a i l : z l j n i t . n e t . c n 微生物发酵生产番茄红素的研究进展 张丽靖杨郁 (浙江大学宁波理工学院分子设计与营养工程市重点实验室, 宁波3 1 5 1 0 0) 摘要: 番茄红素是一种功能性天然色素, 具有抗氧化、 防病抗癌、 增强机体免疫力等生理功能。简要介绍了其理化 性质、 生物合成, 并综述了微生物发酵生产法的研究进展。 关键词: 番茄红素微生物生产 T h eS t u d yo nL y c o p e n eP r o d u c e db yMi c r o o r g a n i s ms Z h a n gL i j i n g Y a n gY u ( k e yl a b o r a t o r yf o rM o l e c u l a rD e s i g na n dN u t r i t i o nE n g i n e e r i n go f N i n g b oC i t y , N i n g b oI n s t i t u t eo f T e c h n o l o g y , Z h e j i a n g U n i v e r s i t y , N i n g b o3 1 5 1 0 0 ) A b s t r a c t : L y c o p e n e i s a k i n do f f u n c t i o n a l n a t u r a l c o l o r a n t s , i t h a s m a n y P h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n , a n t i o x i d a t i o n , a n t i - c a n c e r , e n h a n c i n gi m m u n ea b i l i t ya n ds oo n . T h i s p a p e r i n t r o d u c e db r i e f l yP h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s a n db i o l o g i c a l s y n t h e s i s o f l y - c o p e n e . Mo r e o v e r , t h e a d v a n c e i nf e r m e n t p r o d u c t i o no f l y c o p e n e b y m i c r o o r g a n i s m s w a s r e v i e w e d . K e yw o r d s : L y c o p e n e Mi c r o o r g a n i s m s P r o d u c t i o n 番茄红素是存在于自然界中的一种天然色素, 呈红色, 因最早发现于番茄中得名。主要存在于植 物细胞的有色体中,其中番茄中含量最高,达3 - 1 4 m g / 1 0 0 g。而美国学者最近发现秋橄榄浆果所含 的番茄红素相当于番茄的1 . 8倍 1 。 番茄红素与其他类胡萝卜素一样, 动物自身不 能合成。 由于番茄红素没有类似胡萝卜素那样的芷 香环而没有V A活性, 在过去一直不被重视。然而, 近年研究发现其具有优越的生理功能: 在类胡萝卜 素中, 其抗氧化作用最强。其对单线态氧的淬灭作 用是 -胡萝卜素的2倍, 维生素E的1 0 0倍。同时 还具有防病抗癌, 增强机体免疫力和抗衰老等生理 功能, 在食品、 化妆品以及医药领域具有重要用途, 具有较高的开发和应用价值。 目前世界上番茄红素的开发生产主要有天然 提取、化学合成、微生物发酵等方法。以色列、 日 本、 瑞典、 瑞士、 美国、 法国和澳大利亚等国家以及 罗氏、巴斯夫等跨国公司在此方面处于领先地位, 但目前只在以色列实现了从鲜番茄中提取的商业 化生产 2 。由于番茄中的番茄红素含量很低, 而且 天然提取法产率低且价格昂贵,无法满足需求; 而 化学合成法成本虽有所下降但存在一定不安全性。 随着生物技术的快速发展, 利用微生物发酵生产番 茄红素成为目前的研究热点之一。 1番茄红素的理化特性 1 9 0 3年S c h u n d c发现番茄中提取的这种色素 的 吸 收 光 谱 与 胡 萝 卜 素 不 同 , 将 其 命 名 为L y - c o p e n e。1 9 1 0年Wi l l s t a t l e r和E s c h e r指出番茄红素 是 类 胡 萝 卜 素 的 异 构 体 , 并 首 次 确 定 其 分 子 式 C 4 0H6 0, 分子量为5 3 6 . 5 8, 含1 1个共扼双键及2个 非共扼碳一碳双键。 结晶呈暗紫色, 为脂溶性色素, 不溶于水, 大部分为全反式构型。 性质十分活泼, 易 受氧、 紫外线、 温度的影响而迅速氧化。 在酸性环境 和有C O 2存在的条件下以及温度低于5 0 的酸性 条件下, 色素性能稳定 3 。 2番茄红素的生物合成 异戊烯焦磷酸( I P P )作为番茄红素合成途径中 第1个较为直接的前体物质,是由葡萄糖转化而 生物技术通报B i o t e c h n o l o g y B u l l e t i n2 0 0 6年第4期 来。 番茄红素的类异戊二烯代谢途径合成过程详见 图1。番茄红素经环化酶作用可形成多种类胡萝卜 素 4 。对革兰氏阴性菌欧文氏菌代谢途径的研究发 现从法呢基焦磷酸( F P P )合成番茄红素是由3个c r t 基因( c r t E , c r t B , c r t I )控制 5 。 3番茄红素的微生物法生产 近些年来, 研究人员对利用微生物发酵生产番茄 红素方面进行了大量研究, 涉及微生物主要有三孢 布拉氏霉菌( B 1 a k e s l e at r i s p o r a )、 一些基因改造的酵 母菌、 红色细菌及能自身合成番茄红素的革兰氏阴 性非光合菌, 包括萎蔫欧文氏菌( E r w i n i au r e d o v o r a ) 和草生欧文氏菌( E r w i n i ah e r b i c o l a )。下面分别以不 同微生物的发酵生产研究进行简单概述。 3 . 1细菌 红色细菌的番茄红素含量较高, 但未能进行工 业化生产。有一则6 8年专利曾报道用浅红链霉菌 ( S t r e p t o m y c e sr u b e s c e n s )突变株发酵6 d产番茄红素 0 . 5 g / L 6 。最近研究者分离出一分枝杆菌属野生菌 株,在其产生的类胡萝卜素中有8 0 %为番茄红素。 将p H控制在非生长最适宜范围( p H 6 6 . 4 )或在培 养基加入高盐( 8 5 m M氯化钠), 番茄红素产量达7 . 4 m g / g生物量 7 。革兰氏阴性非光合菌, 包括萎蔫欧 文氏菌和草生欧文氏菌虽然也能自身合成番茄红 素, 但含量较低, 主要用于番茄红素生物合成代谢 途径的研究 5 。之后,R o s eM等利用大肠杆菌载体 p AC Y C l 8 4建立携带欧文氏菌控制番茄红素合成 基因的质粒p A C C R TE I B (载有c r t E,B,I ), 将其转 入J M l 0 1大肠杆菌后生产出2 0 0 5 0 0u g / g( D W)的 番茄红素。 3 . 2霉菌 三孢布拉氏霉菌在工业化生产中主要用于 - 胡萝卜素的生产。当在培养过程中添加一些胺类和 杂环氮化合物以抑制细胞内环化酶的活性时, 三孢 布拉氏霉菌合成大量的番茄红素 8 。 不过, 这种抑制 机制一直是用来研究胡萝卜素生物合成途径, 用于 生产则较少。王永生等 9 在培养中添加三孢布拉氏 霉菌合成 -胡萝卜素的前体物质( -紫罗酮和异烟 肼)之后选正确时机添加 -胡萝卜素环化阻断剂, 一定程度地提高了番茄红素的产量。控制环化的另 一个重要条件是p H, 中性偏高有利番茄红素形成, 方法是添加碳酸钠保持发酵液p H 6 . 6以上, 有关工 艺已有专利申请, 产量0 . 1 5 g / L。 G a v r i l o v等人 1 0 添加了烟草的废弃物1 %于霉 菌的发酵液中, 经1 1 0 h发酵, 得到番茄红素约6 0 8 0 m g / 1 0 0 m l。非离子型表面活性剂s p a n - 2 0可以改 变发酵液流体特性和细胞通透性,再加上其水溶 性, 从而有利于细胞内外物质的传递, 达到有利于 番茄红素合成的条件, 因而可使番茄红素生产能力 提高2倍, 达9 8 . 6 m g / L发酵液 1 0 。用三孢布拉氏霉 菌发酵生产技术获得的结晶番茄红素, 经异丁基醋 酸盐再结晶可得到高纯度的反式番茄红素 1 1 。 3 . 3酵母菌 酵母菌本身并不能合成番茄红素, 研究者发现 酵母在生长稳定期能在体内积累的大量麦角固醇, 利 用 麦 角 固 醇 与 类 胡 萝 卜 素 的 生 物 合 成 途 径 在 F P P分 叉 的 特 性 , 通 过 引 入 欧 文 氏 菌c r t E竞 争 F P P, 使之部分从麦角固醇生物合成途径转向番茄 ( 下转第6 6页) 图1番茄红素的生物合成途径 6 0 生物技术通报B i o t e c h n o l o g y B u l l e t i n2 0 0 6年第4期 红素的生物合成。1 9 9 4年S h i g e - y u k iY a m a n o等人 将生物合成番茄红素和胡萝卜素的基因( c r t E, c r t B,c r t I,c r t Y )及 其 启 动 子 插 入 啤 酒 酵 母 ( S a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e )中, 将该酵母菌在选择性 培养基3 0 培养3 d。冷冻干燥离心过滤所得细胞, 再加入丙酮, 破碎细胞, 再用丙酮萃取4次并蒸干 丙酮得到番茄红素的含量为1 1 3 “g / g细胞干重 1 2 。 产蛋白假丝酵母( C a n d i d aU t i l i s )也是工业生产 上应用广泛的酵母菌,经常用于生产单细胞蛋白、 谷胱甘肽及R N A。Y u t a k aM i u r a等 1 3 将欧文氏杆菌 控制番茄红素合成的基因转入产蛋白假丝酵母中, 利用被重组基因的产蛋白假丝酵母培养生产番茄 红素,每1 g干重产蛋白假丝酵母可得到0 . 7 5 8m g 的番茄红素和0 . 4 0 7m g的八氢番茄红素。 3 . 4藻类 藻类中广泛地存在有类胡萝卜素,但以 -胡 萝卜素最为普遍。 国内外学者们在利用藻类发酵生 产类胡萝卜素的生产菌株及工艺方面进行了广泛 的研究, 其中杜氏藻、 红球藻等在国外已被批准用 于商业生产类胡萝卜素 4 。结合三孢布拉氏霉菌研 究,如若在藻类发酵过程中添加合适的阻断剂, 阻 断番茄红素到类胡萝卜素的环化途径, 同样就可以 积累大量的番茄红素。 而利用藻类生产类胡萝卜素 技术的相对成熟, 转化率较高, 这必将会大大促进 微生物发酵生产番茄红素应用潜力。 综上所述, 利用基因工程和生物技术已能部分 控制番茄红素合成过程中前体物质的转化方向, 如 使F P P竞争性地从生成麦角固醇转向番茄红素。 虽 然采用微生物发酵生产番茄红素技术目前未能达 到工业化生产的规模, 但从发展趋势来看, 发酵法 成本及污染相对较低, 如能进一步提高菌体的贮存 力和转化力, 是实现工业化生产番茄红素经济而有 效的途径。 参 考 文 献 1陈伟,丁霄霖.粮食与油脂,2 0 0 2 ,( 7 ) :4 7 4 9 . 2邱建生,张彦雄,刘铁柱.中国食品添加剂, 2 0 0 0 , ( 2 ) : 8 3 8 8 . 3张亚楼.疾病控制杂志,2 0 0 2 ,1 2 ( 4 ) :3 3 0 3 3 4 . 4范永仙,许兴.食品与发酵工业,2 0 0 3 ,2 9 ( 7 ) :6 9 7 4 . 5 H u n t e rC N ,H u n d l eB S ,H e a r s tJ E ,e t a l .JB a c t e r i o l ,1 9 9 4 , 1 7 6 ( 1 2 ) :3 6 9 2 3 6 9 7 . 6 N e l l sH J ,D e l e e n h e e rA P J ,A p p lB a c t e r i o l ,1 9 9 1,7 0:1 8 1 1 9 1 . 7 K e r rS ,C a l C , C a b r a lJ M S ,e t a l . B i o t e c h n o lL e t t ,2 0 0 4 ,2 6 : 1 0 3 1 0 8 . 8T e r e s h i n a V M,F e o f i l o v a E P ,M e m o r s k a y a A S,e t a l .A p p l B i o c h e m M i c r o b i o l ,1 9 9 6 ,3 2 ( 4 ) :4 2 7 4 2 9 . 9王永生,袁其朋,秦敬改, 等.食品科学,2 0 0 3 ,2 4 ( 5 ) :9 7 - 1 0 0 1 0 G a l r i l o vA S .A p p lB i o c h e m M i c r o b i o l ,1 9 9 6 ,3 2 ( 5 );4 9 2 4 9 4 . 1 1E s t r e l l aA ,L o p e z - O r t i zJ F ,C a b r iW,e t a l .T h e r m o c h i m i c a A c t a ,2 0 0 4 ,4 1 7 : 1 5 7 1 6 1 . 1 2 S h i g e - y u k iY ,T o s h i y u k iI ,M a s a y aN ,e t a l .B i o s c iB i o c h e m , 1 9 9 4 ,5 8 ( 6 ) :1 1 1 2 1 1 1 4 . 1 3Y u t a k aM, K e i j i K , H i r o s h i S , e t a l . B i o t e c h n o l B i o e n g , 1 9 9 8 , 5 8 ( 2 8 3 ) : 3 0 6 3 0 8. 1 8 B e r e n y i M, G i c h u k i ST , S c h m i d t J , e t a l . T h e o r A p p l G e n e t , 2 0 0 2 , 1 0 5 : 8 6 2 8 6 9 . 1 9 L a b r a M, I m a z i o S , G r a s s i F , e t a l . P l a n t B r e e d , 2 0 0 4 , 1 2 3 : 1 8 0 1 8 5 . 2