倍他福林对谷氨酸钠大鼠肥胖模型的作用研究

重庆医科大学 硕士学位论文 倍他福林对谷氨酸钠大鼠肥胖模型的作用研究 姓名：庞小翼 申请学位级别：硕士 专业：药理学 指导教师：董志;傅洁民 20070501 重庆医科大学硕士研究生学位论文 英文缩写 B 3 A R 峨 B A T B e t S i b T C T G L D L H D L F F A G l u q S N P Y L E P L D 5 0 E D T A 2 N a M S G C F H F D r a i n h d U C P G T P A C a s e 英汉缩略语名词对照 英文全称 尚a d r e n o c e p t o r w h i t ea d i p o s et i s s u e b r o w n a d i p o s et i s s u e b e t a p h r i n e s i b u t r a m i n e t o t a le h o l e s t e r o l t r i g l y e r i d e l o w - d e n s i t y l i p o p r o t e i n h i g h - d e n s i t y l i p o p r o t e i n f r e ef a t t ya c i d g l u c o s e i n s u l i n n e u r o p e p t i d eY l e p t i n l e t h a ld o s e 5 0 d i s o d i n me t h y l e n e d i a m i n e t e t r aa c e 吐ca c i d m o n o s o d i u mg l u t a m a t e c h o w e d f o o d 1 1 i g h f a t d i e t m i n u t e s h o u r d a y u n c o u p l ep r o t e i n g u a n o s i n et r i p h o s p h a t e a d e n y lc y c l a s e 1 中文名称 1 3 。肾上腺素受体 白色脂肪 棕色脂肪 倍他福林 西布曲明 血清总胆固醇 血清甘油三脂 血清低密度脂蛋白 血清高密度脂蛋白 血清游离脂肪酸 血糖 胰岛素 神经肽Y 瘦素 半数致死量 乙二胺四乙 酸二钠 谷氨酸钠 基础饲料 高脂饮食 分 小时 天 非耦联蛋白 三磷酸鸟苷 腺苷酸环化酶 重庆医科大学硕士研究生学位论文 c A M P P K A A Q P 9 1 N F a c y c l i c a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e p r o t e i nk i n a s eA a q u a p o r i n 9 t u m o l “ n e c r o s i sf a c t o r 2 环磷酸腺苷 蛋白激酶A 水通道9 肿瘤坏死因子a 重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果据我所知。除了文中特别加以标注扣致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意 申请学位论文与资科若有不实之处，本人承担一切相关责任 ， 学位论文作者签名：革出一日期：垄兰z t _ 生上L 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定。印：研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学本人保证毕业离校后，发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借闶学校可以公布学 位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，可以采用影印、缩印或其他手段保 存论文 论文作者签名： 指导教师签名： 重庆医科大学硕士研究生学位论文 倍他福林对谷氨酸钠大鼠肥胖模型的作用研究 摘要 背景与目的： 随着世界上许多国家工业化和城市化水平的不断发展和人类物质 生活水平的不断提高，肥胖症的发病率和死亡率也随之不断上升，世 界卫生组织已明确认定肥胖症是全球成年人最常见的慢性疾病，被列 为世界四大医学社会问题之一。预防和治疗肥胖症已经成为2 l 世纪的 首要健康问题。目前肥胖症的治疗仍以药物治疗为主，而药物治疗的目 的不应仅局限于治疗肥胖症本身，还要有益于肥胖症相关疾病的防治。 经美国F D A 批准曾垄断市场的减肥药西布曲明和奥利司他虽有较好的 疗效，但均有心血管系统副作用。目前，还没有一种安全有效、令人 满意的减肥药物。因此，寻找安全有效的、具有高选择性的减肥药已 成为当前减肥药研究的热点问题。 研究表明，p 3 肾上腺素受体( p 3a d r e n o e e p t o ra g o r f i g t ，良- A R ) 激 动剂能通过促进白色脂肪( w h i t ea d i p o s et i s s u e ，W A T ) 分解和加强棕色 脂肪( b r o w na d i p o s et i s s u e ，B A T ) 非颤栗性产热，达到降低血糖、不 影响食物的摄入量，而显著减轻啮齿类动物体重的效果。目前，国外动 物实验研究表明倍他福林( b e t a p h r i n e , B e t ) 可能是一种选择性肪一A R 激动剂，能显著降低肥胖动物的体重。但迄今为止许多对动物模型有 效的1 8 3 - A R 激动剂在人体却没有明显的作用，其原因可能与人和动物 之间f 1 3 A R 的种属差异性、药物的选择性不同、生物利用度低、半衰 3 减肥药排行榜 重庆医科大学硕士研究生学位论文 期短等有关。迄今为止，国内外还没有研究出一种对人体非常有效的、 具有高选择性的1 3 3 - A R 激动剂用于肥胖症的治疗。 方法： 采用B l i s s 法观测B e t 对小鼠的急性毒性作用，确定半数致死量 ( 1 e t h a ld o s e 5 0 ，L D 5 0 ) ，以初步阐明B e t 的毒性作用和了解其毒性作 用的靶器官，为B e t 的动物药效学实验剂量提供依据。建立谷氨酸钠 诱导( M S G ) 的肥胖大鼠模型，观测B e t 对肥胖大鼠体重、体重增长 值、L e e s 指数、W A T 和B A T 重量、脂肪系数以及生殖器同一部位脂 肪细胞的数目和大小；同时检测B e t 对肥胖大鼠血清总胆固醇( t o t a l c h o l e s t e r o l ，T C ) 、甘油三脂( t r i g l y 舒d e ，T G ) 、低密度脂蛋白( 1 0 w - d e n s i t y l i p o p r o t e i n ，L D L ) 、高密度脂蛋白( h i g h - d e n s i t yl i p o p r o t e i n ，H D L ) 、 游离脂肪酸( f r e ef a t t ya c i d ，F F A ) 和血糖( g l U C O S e ，G l u ) 的影响，以 及对血浆和下丘脑中胰岛素( i n s u l i n ，I N S ) 、神经肽Y ( n e u r o p e p t i d eY ， N P Y ) 和瘦素( 1 e p t i n ，L E P ) 篚J 影响，以探讨B e t 对谷氨酸钠肥胖大鼠的减 肥作用。 结果和结论： 1 观测了B e t 对小鼠的急性毒性作用，灌胃给药L D 5 0 为 8 9 3 6 1 m g k g ，静脉注射给药为1 9 5 5 8m g k g 。 2 ，本实验中M S G 诱导的肥胖大鼠模型复制成功。 3 B e t 可显著降低给药各组的体重、脂肪重量和脂肪系数，增加脂 肪细胞个数、减小脂肪细胞面积，明显降低血清中G l u 、T C 和T G 水 平、升高H D L 水平；对L D L 和F F A 的影响不明显，能显著降低血浆 4 减肥药排行榜 重庆医科大学硬士研究生学位论文 和下丘脑中的I N S 含量；对N P Y 和L E P 的含量影响不明显。 综上所述，我们的研究结果表明：B e t 具有显著的减肥作用， 9 0 m g k g 组减肥作用与S i b 4 m g k g 组相当甚至优于它。B e t 降低体重的 作用机制可能可能与以下因素有关：( 1 ) 促进肥胖大鼠机体的能量代 谢，增加产热，提高基础代谢率；( 2 ) 加速脂肪组织的分解，减少体 内脂肪的储存；( 3 ) 降低T C 、T G 并升高H D L 含量，对肥胖症心血管 并发症具有积极的预防作用；( 4 ) 降低I N S 水平，改善胰岛素抵抗和 高胰岛素血症。 关键词：倍他福林，肥胖动物模型，谷氨酸钠，减肥作用 5 减肥药排行榜 重庆医科大学硕士研究生学位论文 S T U D I E So NT H EA N T I - o B E S I T YE F F E C T So F B E T A P H R I N EI NO B E S EA N I M A LI N D U C E D B Y M O N O S o D I U M L G L U T A M A T E A B S T R A C T B a c k g r o u n da n dp u r p o s e T h em o r b i d i t ya n dm o r t a l i t yo f o b e s i t yi si n c r e a s i n ga sm a n y c o u n t r i e s d e v e l o pa l lo v e rt h ew o r l d T h eW H O h a sc o n f m n e do b e s i t yi st h em o s t c o m m o nc h r o n i cd i s e a s ei na d u l t s I ti sc o n s i d e r e dt ob eo n eo ff o u r m e d i c o s o e i a lp r o b l e m si nt h ew o r l d P r e s e r v a t i o na n dt r e a t m e n to fo b e s i t y h a sb e c o m et h em o s ti m p o r t a n th e a l t hp r o b l e mi nt h e2 1 s tC e n t L l r y ：A t p r e s e n t , t h em o s ti m p o r t a n tt r e a t m e n tm e t h o do fo b e s i t yi sd r u gt r e a t m e n t S i b u t r a m i n e a n d O r l i s t a t r a t i f i e d b y t h e F D A h a v e c a r d i o v a s c u l a r s i d e e f f e c t s N o w a d a y s ，t h e r ei s n tas e c u r ea n d e f f e c t i v ea g e n tt ot r e a tt h eo b e s i t y S ot o f m da 1 1 i g hs e l e c t i v ew e i g h t - r e d u c i n gt a r g e th a sb e c o m ea h o ts p o t M a n ys t u d i e sh a v ei n d i c a t e dt h a tp 3a d r e n o e e p t o r ( 岛一A R ) a g o n i s tc a n r e d u c eb l o o dg l u c o s e 翻玎1 l ml i p i da n db o d yw e i g h tb ys t i m u l a t i n gl i p o l y s i s o fw h i t ea d i p o s et i s s u e ( W A Z ) a n dn o n s h i v e r i n gt h e r m o g e n e s i s ( N S T ) o f b r o w na d i p o s et i s s u e ( B A T ) A n i m a le x p e r i m e n t si n d i c a t e dt h a tB e t a p h r i n e ( B e t ) C a no b v i o u s l yr e d u c eb o d yw e i g h t I tm a yb eas e l e c t i v ep 3 - A R 6 减肥药排行榜 重庆医科大学硕士研究生学位论文 a g o n i s t B u ts o m eB 3 一A Ra g o n i s te f f e c t i v ei na n i m a lm o d e l h a v en oo b v i o u s e f f e c ti nh u m a n ，w h i c hm a yb ec a u s e db yp 3 一A Rs p e c i e sd i f f e r e n c e s ， d i f f e r e n ts e l e c t i v i t y ，b i o a v a i l a b i l i t ya n dh a l f - l i f eo fd r u g ，e ta 1 U pt on O W ， r e s e a r c h e r sa l lo v e rt h ew o r l dh a v e n 、f o u n da l lh i g hs e l e c t i v ea n de f f e c t i v e 1 3 3 - A Ra g o n i s tt ot r e a tt h eo b e s i t yi nh u m a nb e i n g M e t h o d s ： W eo b s e r v e da c u t et o x i ca c t i o no fB e ti nm i c eb yB l i s s ，a n dd e t e r m i n e l e t h a ld o s e 5 0a n dm a x i m a l l yt o l e r a t e dd o s e ，w h i c hp r o v i d e de v i d e n c ef o r a n i m a lp h a r m a c o d y n a m i c s W ed e t e r m i n e di n d e xi no b e s er a t si n d u c e db y M S G ，i n c l u d i n gb o d y w e i g h t , L e e si n d e x e s ，W A T ，B A T , a d i p o s e c o e f f i c i e n t ，t h en u m b e ra n ds i z eo fa d i p o c y t e s ，t o t a lc h o l e s t e r o l ( T C ) ， t r i g l y e r i d e ( T G ) ，l o w - d e n s i t y l i p o p r o t e i n ( L D L ) ，h i g h - d e n s i t y l i p o p r o t e i n ( H D L ) ，f l e ef a t t ya c i d ( F F A ) ，g l u c o s e ( G l u ) ，i n s u l i n ( I N S ) ， n e u r o p e p t i d e ( N P Y ) ，L e p t i n ( L E P ) i np l a s m aa n dh y p o t h a l a r n u st oe x p l o r e t h ea n t i o b e s i t ya c t i o no f B e ti no b e s er a t si n d u c e db yM S G R e s u l B ： 1 O b s e r v a t i o nr e s u l t so fa c u t et o x i c i t yt e s t i n go fB e ti nm i c e ，t h e d e m o n s t r a b l eL D 5 0o fB e ti ss h o w na s8 9 3 6 1 m g k gb yi n t r a g a s t r i c a d m i n i s t r a t i o na n d1 9 5 5 8 m g k gb yi n t r a v e n o u si n j e c t i o ni nm i c e 。 2 O b e s er a tm o d e l sw e r es u c c e s s f u l l yi n d u c e db yM S G 3 B e tc o u l ds i g n i f i c a n t l yr e d u c eb o d yw e i g h t ，a d i p o s et i s s u e ，a d i p o s e c o e f f i c i e n t ，s i z eo fa d i p o c y t e s ，n l mG l u ，T C ，T Ga n dI N Si np l s m a a n d 减肥药排行榜 重庆医科大学硕士研究生学位论文 h y p o t h a l a m u sa n d m c r e a s en u m b e ro fa d i p o c y t e sa n ds e r u mH D L W e f o u n dt h a ti th a dr i os i g n i f i c a n te f f e c to nN P Ya n dL E P C o n c l u d i n g l y ，t h ep r e s e n ts t u d yi n d i c a t e dt h a tB e th a ds i g n i f i c a n t a n t i o b e s i t ya c t i o n T h ee f f e c t so fB e t ( 9 0 m g k g ) w e r ee q u a lt ot h ea c t i o no f S i b ( 4 m g k g ) T h em e c h a n i s m so f B e tm a y b ei l l c l u d i I l 甙1 ) P r o m o t i n ge n e r g y m e m b o l i s mi no b e s er a t s ( 2 ) A c c e l e r a t i n gl i p o l y s i s ( 3 ) R e d u c i n gs e r u mT C a n dT Ga n di n c r e a s i n gs e r u mH D Ll e v e l ，w h i c hh a dp o s i t i v ep r e v e n t i o no n c a r d i o v a s c u l a rc o m p l i c a t i o ni no b e s er a t s ( 4 ) R e d u c i n gs e r u mI N Sa n d i m p r o v i n gi n s u l i nr e s i s t a n c ea n dh y p e r i n s u l i n e m i a K e y w o r d s ：B e m p h r i n e ，o b e s ea n i m a lm o d e l ，s o d i u mg l u t a m a t e ， a n i t i o b e s i t ya c t i o n 8 减肥药排行榜 重庆医科大学硕士研究生学位论文 倍他福林对谷氨酸钠大鼠肥胖模型的作用研究 刖青 随着世界上许多国家工业化和城市化水平的不断发展和人类物质生活水平的 不断提高，肥胖症的发病率和死亡率也随之不断上升。世界卫生组织已明确认定 肥胖症是全球成年人最大的慢性疾病，被列为2 l 世纪世界四大医学社会问题之一。 预防和治疗肥胖症已经成为2 l 世纪的首要健康问题。目前肥胖症的治疗手段主要 包括：膳食控制、加强运动、行为疗法、药物治疗和手术治疗，其中以药物治疗 为主要有效的治疗措施。药物治疗的目的不应仅局限于治疗肥胖症本身，还要有 益于糖尿病等与肥胖症相关疾病的防治。目前临床上应用的减肥药主要包括：食 欲抑制剂、增加能量消耗的药物、抑制肠道消化吸收的药物和中药减肥药。在众 多减肥药中，以S i b 和O r l i s t a t 效果为好，但二者有明显的心血管方面的副作用。其它 减肥药要么因为临床疗效不确切，毒副作用较大，要么因为耐受性差，长期效果 不显著等而难遂人意。迄今为止，人类还没有开发出一种十分满意的减肥药。众 所周知，阢A R 激动剂作为减肥药的研究已二十多年之久，也是目前减肥药研究的 热点方向之一但许多B 3 稿R 激动剂作为减肥药，因为人和动物的种属差异性、 疗效不佳、或因为药物的选择性低、心血管方面的副作用大，最终未能进入临床 试验。 B e t 是天然化合物奥克帕胺( O c t o p a m i n e ) 的半合成衍生物，具有促进脂肪代 谢、降低体重的作用。t o p a m i n e 即羟苯乙醇胺，又名蟑胺，是一种从天然动植 物中获取的具有减肥作用的化合物，被认为是一种纯天然的B 3 A R 激动剂，这也 是第一个以分离方式得到并作为食品添加剂的尚A R 激动剂，在体内转化成辛弗 林( S y n e p h r i n e ) 。前期实验表明，B e t 与S y n e p h r i n e 相比，二者均能有效促进脂 肪分解，但S y n e p h d n e 具有明显的升压副作用。B e t 是S y n t e c h ( S S P F ) 国际公司在 舆克帕胺的基础上合成的一种衍生物( 异丙基奥克帕胺) ，具有促进脂肪分解、降 低体重的作用。人体脂肪细胞脂解实验中，B e t 可呈剂量依赖性促进脂肪细胞脂解， 其作用强于辛福林。家兔禁食2 4 h 后注射给予0 4 m g k g h 的倍他福林，l O m i n 后家 9 减肥药排行榜 重庆医科大学硕士研究生学位论文 兔肾周脂肪组织游离脂肪酸水平明显升高，而此剂量对动脉血压没有影响，由此 推测B e t 可能是一种选择性1 3 3 A R 激动剂。目前国内外还没有一种高选择性尚A R 激动剂作为减肥药正市上市。 基于以上研究背景，本课题的目的旨在通过观测B e t 对小鼠静脉注射和灌胃给 药的急性毒性作用，确定L D 5 0 ，以初步阐明倍他福林的毒性作用和了解其毒性靶 器官，为B e t 的动物药效学剂量提供依据。同时建立谷氨酸钠大鼠肥胖模型，观测 B e t 对肥胖大鼠体重、体重增长值、L e e s 指数、W A T 和B A T 重量、脂肪系数以 及生殖器同一部位脂肪细胞数目和大小的影响；检测B e t 对肥胖大鼠T C 、T G 、L D L 、 H D L 、F F A 、G l u 的影响，以及对血浆和下丘脑中I N S 、N P Y 、L E P 的影响，以探 讨B e t 对谷氨酸钠肥胖大鼠的减肥作用。 论文共分三部分： ( I ) B e t 对小鼠的急性毒性研究 ( I I ) B e t 对谷氨酸钠肥胖大鼠的影响 ( ) 探讨B e t 对谷氨酸钠肥胖大鼠减肥作用的机理 1 0 减肥药排行榜 重庆医科大学硕士研究生学位论文 第一部分倍他福林对小鼠的急性毒性研究 目前，国内外均未见高选择性的P 3 一A R 激动剂作为减肥药上市的成功报道。 为了寻找高选择性岛A R 激动剂作为减肥药进行研究，并探讨这一药物的安全性， 本实验完成了B e t 对小鼠的急性毒性实验，对其安全性作出初步评价，以指导B e t 下一步的动物药效学实验。 1 材料与方法 1 1 实验材料 1 1 1 主要试剂 B e t ( 原料药) 0 9 生理盐水 1 1 2 主要仪器 电子天平B L l 5 0 小鼠灌胃针 小鼠尾静脉注射固定器 D A S 软件分析系统 1 1 3 实验动物 美国盛代国际有限公司 重庆大新药业股份有限公司 北京赛多利斯仪器系统有限公司 上海博友科教仪器设备有限公司 上海博友科教仪器设备有限公司 安徽省药物临床评价中心研制 昆明系小白鼠，9 8 各半，1 8 2 2 9 ，由重庆中药研究所实验动物中心提 供。 1 2 实验方法 1 2 1 预实验 根据相关指导原则【1 1 ，找出小鼠灌胃给药的1 0 0 估计致死剂量。用O 9 生 理盐水配制不同浓度的药液，分别为5 0 0 0 m g k g 、3 0 0 0 m g k g 、2 0 0 0 m g k g 和 1 5 0 0 m g k g ，以0 2 m l 1 0 容量一次性灌胃给药，每个剂量组各试5 只小鼠，根据实 l l 减肥药排行榜 重庆医科大学硕士研究生学位论文 验结果，找出小鼠灌胃给药l o o 的致死剂量为2 0 0 0 m g k g 。此外，用O 9 生理盐 水配制不同浓度的药液，分别为3 0 0 m g k g 、2 0 0 m g k g 和1 0 0 m g k g ，以0 2 m l 1 0 9 容 量一次性静脉注射给药，每个剂量组各试5 只小鼠，找出静脉注射给药1 0 0 的致 死剂量为3 0 0 m g k g 。 1 2 2 正式实验 1 实验分组 灌胃给药：随机分成7 组，每组1 0 只，组问剂量比为0 8 田，各组剂量分别 为：2 0 0 0m g k g 、1 6 0 0m g k g 、1 2 8 0m g k g 、1 0 2 4m g k g 、8 1 9 2m g k g 、6 5 5 3 6m g k g 和5 2 4 2 9m g k g 。 尾静脉注射给药；随机分成6 组，每组l O 只，组间剂量比为O 8 5 ，各组剂量 分别为3 0 0 m g k g 、2 5 0 m g k g 、2 1 2 5 m g k g 、1 8 0 6 3 m g k g 、1 5 3 5 3 m g k g 和1 3 0 5 0 m g k g 。 2 实验方法 给药前禁食1 2 h ，不禁水；给药后再禁食3 4 h ，以0 2 m l 1 0 容量一次性给药， 立即仔细观察小鼠中毒反应及死亡情况，并认真作好记录。 1 2 3 观测指标 1 一般指标( 动物外观、呼吸、心率、中枢神经系统情况、行为、对刺激的反 应、分泌物、排泄物等) ，动物死亡情况( 死亡时间、濒死前反应等) 。 2 对死亡动物立即行尸体解剖，观察主要脏器的肉眼变化。 1 3 统计学处理 以D A S 软件系统采用B l i s s 法进行分析，计算L D 5 0 及9 5 的可信艰。 减肥药排行榜 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2 结果 2 1 灌胃给药的急性毒性结果 小鼠一次性灌胃给药的最大致死剂量2 0 0 0 m g k g ，L D 5 0 为8 9 3 6 1 m g k g ，9 5 可信限为7 7 5 4 3 1 0 2 9 7 4 m g k g ( 见表1 ) 。给药后观察发现，在给药后半小时内， 中毒小鼠均有不同程度的中枢兴奋、不安、躁动，随后全身抽搐、惊厥、运动困难， 最后呼吸抑制而死亡，剂量越高以上反应越明显，对死亡小鼠立即行尸体解剖，裸 眼下观察心、肝、肾、肺、脑、脾等重要器官，无明显异常发现。死亡情况集中 在给药后半小时之内，存活小鼠3 0 m i n 后逐渐恢复正常，对存活小鼠连续观察1 4 d ， 一般情况良好，未见其他毒性反应情况出现，死亡情况未继续发生。 表1 倍他福林一次灌胃给药的小鼠急性毒性实验结果 ( L O S 0 d a U s s 法) T a b 1R e s u l t so f a c u t et o x i c i t yt e s t i n go f B e tb yi n t r a g a s t r i ca d m i n i s t r a t i o ni nm i c e 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2 2 尾静脉注射给药的急性毒性结果 小鼠一次性静脉注射给药的最大致死剂量为3 0 0 m g & g ，L D 5 0 为1 9 5 5 8m g l c g ， 9 5 n - J 信限为1 7 9 7 5 6 2 1 2 7 9m e , 瓜g ( 见表2 ) 。给药后反应同灌胃给药，连续观 察1 4 d ，一般情况良好，未见其他毒性反应情况出现，死亡情况未继续发生。 表2 倍他福林一次性尾静脉注射给药的小鼠急性毒性实验结果 ( 1 , D S 0 , B 酗法) T a b 2R e s u l t so f a g u g et o x i c i t yt e s t i n go f B e tb yi n t r a v e n o u si n j e c t i o ni nm i c e 3 讨论 L D 5 0 反映药物的毒性大小，其值越大，表明该药的毒性越小，安全范围越大 脚。本实验采用简化机率单位法，测得B e t 灌胃给药的最大致死剂量为2 0 0 0 m g k g ， L D 5 0 为8 9 3 6 1 m g & g ，9 5 可信限为7 7 5 4 3 1 0 2 9 7 4 m g k g ：静脉注射给药的最 大致死剂量为3 0 0m 非g ，L D S 0 为1 9 5 5 8m g 瓜g ，9 5 n - 信限为1 7 9 7 6 2 1 2 7 9 m g k g ，国外实验L D 5 0 为t 4 4m g 缓g ，与资料接近。 1 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 4 结论 以上实验结果表明，B e t 对小鼠具有一定的毒性，对小鼠呼吸系统、循环系统 和中枢神经系统有一定的抑制作用，剂量越高抑制作用越明显，对其它系统没有 发现明显的毒性反应。小鼠灌胃给药L D 5 0 为8 9 3 6 1 m g k g ，9 5 可信限为7 7 5 4 3 1 0 2 9 7 4 m g k g ：静脉注射给药的L D 5 0 为1 9 5 5 8m g k g ，9 5 0 - “ 信限为1 7 9 7 6 2 1 2 7 9m g k g 。 重庆医科大学硬士研究生学位论文 第二部分倍他福林对谷氨酸钠肥胖大鼠的影响 1 材料与方法 1 1 实验材料 1 1 1 主要试剂 B e t ( 原料药) S i b u - t r a m i n e ( 原料药) L 谷氨酸钠 血糖试剂盒 甘油三酯试剂盒 总胆固醇试剂盒 高密度脂蛋白胆固醇试剂盒 低密度脂蛋白胆固醇试剂盒 游离脂肪酸试剂盒 乙酸( 冰醋酸) 分析纯含量之9 9 5 戊巴比妥钠含量猡5 O 甲醛溶液含量3 7 4 0 ，分析纯 E D T A 2 N a ，分析纯 1 1 2 主要仪器 I V S - 4 1 0 推拉式切片机 日立7 0 2 0 型全自动生化分析仪 C P 6 4 型电子天平 D L 5 B 型低速大容量离心机 K K 2 2 E 0 0 1 1 西门予冰箱 M D F U 5 4 1 1 立式低温冰箱 内切式组织匀浆考L z s 8 3 1 型 1 6 美国盛代国际有限公司 重庆圣华曦药业有限公司 湖州生物化学厂 四川省迈克科技有限责任公司 四川省迈克科技有限责任公司 四川省迈克科技有限责任公司 四川省迈克科技有限责任公司 四川省迈克科技有限责任公司 四川省迈克科技有限责任公司 上海申搏化工试剂公司 中国医药上海化学试剂公司 重庆东方试剂厂 重庆化学试剂厂 日本樱花公司 日立高新技术公司 德国s a r t o r i u s 公司 上海安亭科学仪器厂 德国西门子公司 日本三洋 浙西机械厂 重庆医科大学硕士研究生学位论文 K Q 5 0 0 B 型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司 1 1 , 3 实验动物 W i s t a r 大鼠，早8 各半，4 0 6 0g 由重庆中药研究所实验动物中心提供。 1 2 实验方法 1 2 1 谷氨酸钠肥胖动物模型的复制 1 M S G 诱导肥胖的机制：M S G 诱导动物肥胖系因损伤下丘脑弓状核( A N H ) 的饮食中枢，特别是结节漏斗处多巴胺内分泌系统及其他功能低下所致的代谢性 功能失调性肥胖，其模型动物特点是肥胖，轻度少食和活动减少。 2 造模方法：出生2 4 小时的新生W i s t a r 乳鼠置于室温2 2 左右的环境中， 适应性喂养1 天后造模，随机从每窝中抽取几只，按3 0 的M S G0 0 1 m l g 皮下注 射( 颈背部) 给予，严格执行无菌操作，同时将各窝中剩余的乳鼠作为空白对照组， 颈背部皮下注射同等剂量的O 9 的生理盐水，连续注射5 天，2 1 天断乳后，筛选 出造模成功的模型动物。造模成功的标准：体重超过对照组平均体重的2 0 视为 造模成功。 1 2 2 实验动物分组 将筛选合格的W i s t a r 肥胖大鼠随机分为五组，即：模型对照组、B e t l o m g k g 、 B a 3 0 m g k g 、B e t 9 0 n I 眺g 、阳性对照药S i b 4 m g k g 和空白对照组共六个实验组。空 白对照组和模型对照组每天灌胃给予O 9 0 , 4 的生理盐水，其余各实验组分别灌胃给 予B e t 和S i t ) ，连续3 5 天；空白对照组喂以基础饲料( c h o w e d - f o o d ，O F ) ，模型 和各给药组均喂以高脂饮食删g l lf a td i e t ，H F D ) ，不限量。 基础饲料配方：大麦粉2 0 0 ，脱水菜( 去除水分的包心菜) 1 0 ，豆粉2 0 0 , 6 ， 酵母1 ，骨粉5 ，玉米粉1 6 ，麸皮1 6 ，鱼粉1 0 0 , 6 ，食盐2 。 营养饲料配方；每1 0 0 0 9 基础饲料加奶粉1 0 0 9 ，猪油1 0 0 9 ，鸡蛋1 0 个，浓 鱼肝油1 0 0 滴( 含维生素A 1 7 x 1 0 U ，维生素D 1 7 1 0 4 U ) ，每天喂适量的新鲜豆芽 约2 5 0 9 。 1 2 3 观察指标 1 体重：禁食6 1 2 小时后称重，每周一次 1 7 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2 体重增长值= 给药后的体重一给药前的体重 3 体长：取血前用4 0 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后准确测量其体长( 从鼻尖 至肛门的长度) 4 L e e S 指数_ 2 4 体重( g ) x 1 0 3 体长( 锄) 5 W A T 重量：取子宫、睾丸、肾周围的脂肪组织称其湿重 6 B A T 重量：取肩胛间脂肪组织称其湿重 7 脂肪系数= 脂肪组织重量体重1 0 0 8 脂肪细胞个数及大小：取生殖器周围同一部位的脂肪组织- - d 块，用4 0 甲醛液固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明、浸腊、包埋、切片( 5 I _ t m ) ，H E 染色， 封片，光学显微镜下计数全部脂肪细胞个数，并测量脂肪细胞的面积，每张切片 计数l O 个视野的细胞数和细胞面积，取平均值作为每例的值 9 血清中T G 、T C 、F F A 、L D L 、H D L 和G l u 水平：动物轻度麻醉后摘眼取 血，3 0 0 0 转m i n 离心，5 1 0 m i n ，提取血清采用全自动生化仪测量 l O 血浆I N S 、L E P 和N P Y 含量测定：动物轻度麻醉后摘眼取血，将静脉血 注入含有1 0 E D T A - 2 N a 4 0 0 t 的试管中，混匀，3 0 0 0 转m i n 离心，5 1 0 m i n ，提 取血浆( 注意溶血，溶血样品会影响测定结果) ，采用放射免疫法检测各指标 1 1 下丘脑I N S 、L E P 和N P Y 含量测定：将取血后的实验动物断头，迅速在 冰盘上取下下丘脑，经内切式组织匀浆机处理后离心提取上清液，于2 0 “ C 保存待 测。采用放射免疫法检测各指标 1 3 统计学处理 所得结果均以均数标准差( i 4 - S D ) 表示，所有数据以S P S S l 2 0 1f o r w i n d o w s 进行单因素方差分析。 1 8 重庆医科大学硕士研究生学位论文 2 结果 2 1 倍他福林对肥胖大鼠体重的影响 表1 1 倍他福抹时肥胖雄性大鼠体重( g ) 的影响 T a L l 1E f f e c to f B e t o m t h e b o d y w e 蛐t i n m a l e o b e s J t yr a t s ( i 蟠Dr l o ) 袁1 2 倍佑梧蒜砖息辟雌基大文体重的影响 T a b I JE f f e c to f B e t t h eb o d yw e i g h tJ nf e m a l eo b e s i t yr a t s r i 珊n = l o ) V e h i c l e 如翻 I 0 8 士2 9 64 7 4 3 士5 0 77 1 2 “r 士6 7 09 6 4 2 1 3 1 51 3 4 4 7 士1 3 9 11 ：3 4 6 5 士8 6 1 5 11 1 土量4 2 7 2 , 0 1 士9 4 0 I 弼5 9 2 & 7 5 l 驾0 7 1 1 4 - -i 弼0 2 1 0 7 1 + 一1 6 3 3 5 1 0 0 4 B e t l O m g 他 5 1 0 8 “ 4 - 8 9 5 e a 3 0 m 窨力, s 5 1 1 7 8 ，5 4 B 栅m S k S 5 10 8 2 8 鲐 7 9 7 4 - t “ 1 0 1 21 0 1 6 8 8 9 6 1 3 9 2 5 ：1 ：9 4 6 1 5 7 9 3 ： ：1 53 ，1 6 67 5 士1 4 3 7 6 5 0 0 士1 1 6 8 “ 9 S 士l O 格 7 4 2 0 7 4 4 1 0 3 4 1 1 5 ，0 21 3 57 4 士1 5 6 11 4 85 0 1 7 3 51 5 5 6 5 1 8 4 3 9 8 0 2 1 1o 严1 3 3 6 8 + 1 0 9 71 4 5 并争矿 1 5 0 5 1 2 I0 6 A 1 0 1 2 0 士& 9 61 2 86 7 1 0 6 5 1 3 8 1 3 1 2 7 “1 4 6 5 0 1 3 4 2 “ 注：6 ， 0 0 5 。本实验中B e t 对肥胖雌性大鼠血浆I N S 影响不明显， 可能是由于标本收集和处理是时间控制不严格等引起。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 表1 1 3 倍他福林对肥胖大鼠血浆L E P ( g m D 水平的影响 T a b 1 1 3 E f f e c t o f B e t O D t h e l e v e l o f p l a s m l e p t i n i n o b e s i t y - r a t s ( i ：I ：S Dn - 3 ) 从表1 1 3 看出，与空白组比较，模型组雌雄血浆瘦素水平均无差异性，P 0 0 5 ， 与模型组比较，B e t 各组和S i b 4 m g k g 组雄雌大鼠血浆瘦素水平无差异性，P 0 0 5 。 一种情况表明B e t 本身对血浆瘦素水平无调节作用；另一种情况可能是由于造模时 本身没有引起血浆瘦素水平的异常变化；另外，标本收集和处理不当也可能引起 上述结果，从而导致给药各组瘦素水平没有改变，具体原因还有待进一步实验。 2 6 2 倍他福林对肥胖大鼠下丘脑中N P Y 、I N S 和L E P 含量的影响 表1 1 4 倍他福林时肥胖大鼠下丘脑中N P Y ( p g m 1 ) 和I N S ( m V m 删影响 T a b 1 1 4 E f f e c t o f B e t O R t h e l e v e l o f H T n e u s o p e p t i d e Y a n d i n s u l i n i n o b e s i t y - r a M ( i ：t ：S Dn _ 3 ) 6 6 P 0 0 5 。表明受试药B e t 可能对下丘脑中神经肽Y 没有影响，B e t 的减肥作用可能与体内神经肽Y 的参与无关。本实验中空白组与模型之间无差异 性，说明可能在造模过程中并没有引起神经肽Y 的异常改变，导致上述结果的出 现。 B e t 对肥胖雄性大鼠下丘脑中胰岛素的影响：表1 1 4