HBVDNA检测在乙肝治疗中的应用.pptx

为什么进行HBV DNA检测 HBV DNA检测带给我们的益处 目前HBV DNA的检测方法 罗氏COBAS Amplicor系统的优点 新一代技术COBAS TaqMan,主要内容,乙型肝炎：全球性的健康问题,目前HBV携带者超过 350 million 2540% HBsAg 阳性人群会死于肝硬化或肝癌 全球350 million HBV 携带者, 75% 在亚洲,中表面抗原（S+preS2）,核蛋白壳 HBcAg (HBeAg),DNA 聚合酶,膜蛋白,基因组 DNA,小表面抗原 HBsAg (S),RNA 引物,大表面抗原 （S+preS2+preS1),乙肝病毒颗粒示意图,慢性乙肝检测指标,HBsAg 确定慢性乙肝 HBeAg/ anti-HBe 区分感染的不同时期 HBV 聚合酶 检测病毒的酶活性 HBV DNA 检测病毒载量 (病毒转录活性) HBcAg 检测病毒蛋白 (病毒翻译活性),HBV 病毒基因,慢性乙型肝炎,暴露后时间,滴度,ALT,Anti-HBc,Symptoms,5,6,0,1,2,3,4,6,7,1,2,3,4,5,8,9,10,HBsAg,HBeAg,月,年,HBV DNA,Anti-HBe,慢性乙肝的三种临床表现,HBeAg 阳性慢性乙肝 HBeAg, ALT升高, HBV-DNA 107 to 1011 拷贝每毫升 ， 病理切片指征明显 HBeAg 阴性慢性乙肝 Anti-HBe, ALT升高 ， HBV-DNA 104 to 108拷贝每毫升 ,病理切片指征明显 HBsAg 阴性携带期 Anti-HBe, ALT正常, HBV-DNA 101 to 104拷贝每毫升 ,病理切片变化极小,EASL（欧洲肝病学会）将显著的复制水平定为HBV-DNA 10 5 拷贝每毫升,HBV保持复制活性（HBV DNA105 copies/mL）,转氨酶36月内 持续升高，建议进行治疗 对于e抗原阳性的慢性乙肝患者而言，采用干扰素治疗结束后，应该 检测e抗原、e抗体和HBV DNA水平，并且每6个月评估病毒学反应 对于e抗原阴性的慢性乙肝患者而言，在经过抗病毒治疗后，检测血 清HBV DNA水平是评估病毒学反应的唯一方式,欧洲肝病学会（EASL）2003乙肝防治指南,/article/PIIS0168827803003787/fulltext#section7,HBV-DNA 血清阳性病人，如果ALT 2ULN, 要考虑治疗 治疗期间， ALT、 e抗原和HBV-DNA至少每3个月检测一次,亚太乙肝防治共识2003,Journal of Gastroenterology and Hepatology (2003) 18, 239245,抗病毒一般适应症主要指标：HBV DNA 105 拷贝/mL 病毒学应答重要指标包括血清HBV，DNA 检测不到 (PCR 法) 或低于检测下限，或较基线下降2log10,中华医学会肝病学分会/中华医学会感染病分会 慢性乙肝防治指南,/GB/14740/21474/56295/index.html,为什么进行HBV DNA检测 HBV DNA检测带给我们的益处 目前HBV DNA的检测方法 罗氏COBAS Amplicor系统的优势 新一代技术COBAS TaqMan,主要内容,HBV DNA检测带给我们的益处,监测抗病毒治疗效果 早期确定病毒学应答预测治疗后反应 (HBsAg 消失) 预测耐药突变 预测肝移植后复发 检测HBsAg 携带者的病毒的活动情况,经治疗生化指标正常病人中病毒清除率,治疗中/后，应答者与不应答者HBV DNA水平的比较,监测抗病毒治疗，预测耐药,Puchhammer-Stockl E. at al. J Infect Dis 181:2063, 2000,HBV DNA 载量显示携带者处于活动或非活动状态,HBV DNA copies/ml,Manesis K. et al.Gastroenterology 122 (7): 2092-3, 2002.,HBV DNA载量在肝移植中的应用,在肝移植中 (Liver Transplantation) 为防治肝移植后的复发所采取的预防性治疗需要达到HBV DNA104 copies/mL 的指标,为什么进行HBV DNA检测 HBV DNA检测带给我们的益处 目前HBV DNA的检测方法 罗氏COBAS Amplicor系统的优势 新一代技术COBAS TaqMan,主要内容,目前HBV DNA的检测方法,罗氏COBAS Amplicor HBV Monitor Digene Hybrid Capture 杂交捕捉 Abbott Genostix 已消失 Bayer bDNA 3.0 国产HBV DNA检测试剂及方案 罗氏COBAS TaqMan HBV monitor,灵敏度比较,Technology,LOD,copies/,mL,Roche AMPLICOR,300,Digene Hybrid Capture, 140,000,Abbott Genostix, 500,000,Bayer bDNA 3.0, 2,000,Roche Cobas Taqman, 35,国产试剂,？,Branched DNA (bDNA),靶探针 *,Preamplifier *,Microwell,靶 DNA,捕获 探针,微孔板捕获探针,Amplifier * with hybridized Label Probes*,* components containing Iso-C/Iso-G,信号扩增,Branched DNA (bDNA),国内Real time方法 HBV 的检测现状,PCR反应,Mg2+,dCTP,dGTP,dUTP,dATP,Taq DNA Polymerase,AmpErase,Target DNA,PCR,模板扩增,1 cycle = 2,2 cycle = 4,3 cycle = 8,4 cycle = 16,5 cycle = 32,6 cycle = 64,7 cycle = 128,Single strand RNA,水解探针 (TaqMan) 模式,淬灭基团,报告荧光,激发荧光,淬灭激发荧光,检测到信号,实时荧光定量模式,0,5,10,15,20,25,30,0,10,20,30,40,50,60,相对荧光强度,None,1,Threshold,Cycle Threshold (Ct),for 108,C/PCR,HBV DNA,Log C/PCR,2,8,7,6,5,4,3,循环数,需要关注的国内实时荧光PCR检测的问题,仪器90源于进口，ABI、ROCHE、Bio-Rad 试剂100国产，匹基、达安、科华、复星,需要关注的国内实时荧光PCR检测的问题,目前国内使用的进口Realtime PCR仪全部是针对科研用途研发的，缺乏临床诊断所需的质控系统 所有进口PCR仪均为开放系统，除Roche外均不提供临检用试剂 仪器厂家仅负责仪器运行是否正常，不对检测结果做任何保障,均采用外部标准曲线定量，标准品为重组质粒，与临床标本有无差异？ 质控品及标准品有无朔源性？ 试剂是否标明“域值”或“Cross Band” 取值范围？ 阳性质控是否给出标准值范围？ 标准品浓度是否覆盖声明的检测灵敏度？ 是否提供内部质控品？ 纯化产率如何控制？,需要关注的国内实时荧光PCR检测的问题,检测结果标准化的问题,为什么进行HBV DNA检测 HBV DNA检测带给我们的益处 目前HBV DNA的检测方法 罗氏COBAS Amplicor系统的优点 新一代技术COBAS TaqMan,主要内容,COBAS Amplicor 检测原理,杂交 (37 C),PCR扩增,变性,杂交,清洗,加AV-HRP,加TMB,内部标准品(QS)全程监控样本制备/PCR过程 兼作定量参照,模板 DNA,内部标准品 DNA,COBAS Amplicor： 与固定在磁珠上的探针杂交,内对照防止假阴结果，精确定量,PCR,COBAS AMPLICOR HBV Monitor特点,检测下线300 copies/mL, 95% 检出率 线性范围 300- 200,000 copies/mL 同等定量亚型 A-F 血清或血浆 100 ul 样本 6 小时检测时间, 30 分钟手工准备 内部定量标准 防污染系统,COBAS Amplicor VS bDNA,COBAS Amplicor vs bDNA,COBAS Amplicor vs bDNA,COBAS Amplicor HBV 灵敏度vs 其它测试,?,- 预测反跳？ - 预测突变？ - 预测肝移植复发风险？,其他测试的灵敏度,COBAS Amplicor HBV 灵敏度,1,10,100,1,000,10,000,100,000,1,000,000,10,000,000,100,000,000,0,4,8,12,20,24,Weeks of therapy,HBVDNA copies/mL,为什么进行HBV DNA检测 HBV DNA检测带给我们的益处 目前HBV DNA的检测方法 罗氏COBAS Amplicor系统的优势 新一代技术COBAS TaqMan,主要内容,COBAS TaqMan 实时荧光检测系统,COBAS TaqMan特点及益处,动态 PCR 整合定量标准，不需外标准曲线 检测管封闭，无需开盖 四色荧光通道 (计划升级到六色) 检测管: k-tube or k-plate,宽广的动力学范围 连续检测 检测时间从6小时减少到23小时 增加通量 提供内质控 减少污染风险 允许多重PCR靶标检测 可用于其他检测模式 (杂交探针) 处理过程简单 可与AmpliPrep联用，实现自动化,益 处,特 点,COBAS TaqMan定量