《RNA转录》PPT课件.pptVIP

生物化学 多媒体课件试用版,第十一章,( RNA Biosynthesis, Transcription ),RNA的生物合成 转录,Biochemistry Department Department of Basic Medical Sciences Hangzhou Normal University Guyisheng,2019/8/4,2,转录 (transcription) 是生物体以DNA为模板合成RNA的过程 。,转录,2019/8/4,3,RNA的合成方式,在生物界，RNA合成有两种方式：一是DNA指导的RNA合成，此为生物体内的主要合成方式。另一种是RNA指导的RNA合成，此种方式常见于病毒。 转录产生的初级转录本是RNA前体（RNA precursor），需经加工过程（processing）方具有生物学活性。,复制和转录的区别,2019/8/4,5,参与转录的物质：,原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板: DNA 酶 : RNA聚合酶(RNA polymerase, RNA-pol) 其他蛋白质因子,2019/8/4,6,DNA双链在转录过程中只有一条链中的其中某一活化基因片段起作用，该链称模板链（template strand），又称有意义链或Watson链； 与其互补的链称为编码链（coding strand），又称反义链或Crick链。,一、转录模板,转录生成的RNA链与编码链的碱基序列相似，以U取代T,第一节 原核生物的转录模板和酶 Templates & Enzymes in Prokaryotic Transcription,2019/8/4,7,模板链与编码链,5GCAGTACATGTC 3,3 c g t g a t g t a c a g 5,5GCAGUACAUGUC 3,NAla Val His Val C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,2019/8/4,8,DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因(structural gene)。,不对称转录：,某一确定活化基因的转录，只能以DNA双链的一条链作为模板，这种现象称为不对称转录（asymmetric transcription）。,两重含义： 一是指双链DNA只有一股单链用作模板。 二是指同一单链上可以交错出现模板链和编码链。,2019/8/4,9,5 3,3 5,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,不对称转录,2019/8/4,10,二、RNA聚合酶 (DNA dependent RNA polymerase, DDRP, RNA-pol),（一）RNA聚合酶能直接启动RNA链的合成,DNA依赖的RNA聚合酶催化合成RNA； RNA合成的化学机制与DNA依赖的DNA聚合酶催化DNA合成相似。,( NMP )n + NTP ( NMP ) n+1 + PPi,RNA,延长的RNA,2019/8/4,11,DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接启动RNA链的延长。 RNA聚合酶和DNA的特殊序列启动子(promoter)结合后，就能启动RNA合成。,2019/8/4,12,（二）RNA聚合酶由多个亚基组成,大肠杆菌（E.coli）RNA 聚合酶：4种亚基、组成的五聚体蛋白质，分子量480 kD。,2019/8/4,13,核心酶（core enzyme） ： 2 能催化NTP按模板的指引合成RNA，在转录延长全过程中均起作用,全酶（holoenzyme）： 2 ，即亚基 + 核心酶 亚基的功能是辨认转录起始点，转录起始阶段需要全酶,2019/8/4,14,全酶 (holoenzyme),转录起始阶段,转录延长阶段,核心酶 (core enzyme),结合,2019/8/4,15,三、RNA聚合酶与模板的辨认结合,转录是不连续、分区段进行的。 每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)。操纵子包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。,RNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子(promoter)。,2019/8/4,16,启动子（promotor）：,调控序列中的启动子是RNA聚合酶识别、结合并开始转录的一段DNA序列。也是控制转录的关键部位。 原核生物以RNA聚合酶全酶结合到DNA的启动子上而起动转录；其中由亚基辨认启动子，其他亚基相互配合。 启动子序列按功能的不同可分为三个部位，即起始部位、结合部位、识别部位。,2019/8/4,17,起始部位：,指DNA分子上开始转录的作用位点，该位点有与转录生成RNA链的第一个核苷酸互补的碱基，该碱基的序号为+1。,识别部位： RNA 聚合酶亚基的识别部位。 中心部位在35bp处,该序列的碱基富含TTGACA。,2019/8/4,18,结合部位：,是DNA分子上与RNA聚合酶的核心酶结合的部位，其长度为7bp，中心部位在10bp处。 碱基序列具有高度保守性，富含TATAAT序列，故称之为 TATA盒（TATA box），又称普里布诺序列（Pribnow box）。 该序列中富含AT碱基，维持双链结合的氢键相对较弱，导致该处双链DNA易发生解链，有利于RNA聚合酶的结合。,2019/8/4,19,RNA聚合酶保护法,2019/8/4,20,用RNA聚合酶保护法研究转录起始区,结合,2019/8/4,21,第二节 原核生物的转录过程 The Process of Transcription in Prokaryote,大肠杆菌转录过程包括转录起始、延长、终止三步。,2019/8/4,22,一、转录起始需要RNA聚合酶全酶,转录起始不需引物，两个与模板配对的相邻核苷酸，在RNA-pol催化下生成磷酸二酯键直接连接起来。转录生成的第一个核苷酸总是GTP或ATP ,以GTP更为常见。 转录起始复合物 ： RNA聚合酶的全酶、DNA模板和四磷酸二核苷酸（pppGpN-OH 3）三者结合在一起的复合体。,2. DNA双链局部解开，形成开放转录复合体(open transcription complex) ；,1. RNA聚合酶全酶(2)与模板结合，形成闭合转录复合体(closed transcription complex) ；,3. 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物：,RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3,转录起始复合物:,5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi,转录起始过程：,2019/8/4,24,第一个磷酸二酯键生成后，亚基即从转录起始复合物上脱落，核心酶连同四磷酸二核苷酸，继续结合于DNA模板上，酶沿DNA链前移，进入延长阶段。,2019/8/4,25,E.coli的转录起始和延长,2019/8/4,26,二、 原核生物的转录延长时蛋白质的翻译也同时进行,1. 亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2. 在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi,转录空泡(transcription bubble)：,RNA-pol （核心酶） DNA RNA,2019/8/4,28,转录空泡的形成：,转录空泡（transcription bubble）：也称转录复合物，是由RNA聚合酶的核心酶、DNA模板和转录产物RNA三者结合在一起的复合体。 RNA 聚合酶亚基辨认启动子识别部位。在这一区段，酶与模板的结合很松弛，酶随即移向启动子的结合部位，并跨入了转录起始点，开始转录。 第一个磷酸二酯键生成后， 亚基从转录起始复合物上脱落，形成转录空泡。核心酶沿模板DNA前移，进入延长阶段。,转录延长：,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,在同一DNA模板上，有多个转录同时在进行； 转录尚未完成，翻译已在进行。,这种形状说明：,2019/8/4,31,依赖Rho 因子的转录终止 非依赖Rho因子的转录终止,三、原核生物转录终止分为依赖(Rho)因子与非依赖因子两大类,转录终止指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。,依据是否需要蛋白质因子的参与，原核生物转录终止分为：,2019/8/4,32,因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质，亚基分子量46kD。 因子能结合RNA，又以对poly C的结合力最强。 因子还有ATP酶活性和解螺旋酶(helicase)的活性。,（一）依赖因子的转录终止,因子：,2019/8/4,33,因子的作用原理：,2019/8/4,34,目前认为，因子终止转录的作用是：与RNA转录产物结合，结合后因子和RNA聚合酶都可发生构象变化，从而使RNA聚合酶停顿，解螺旋酶的活性使DNA/RNA杂化双链拆离，利于产物从转录复合物中释放 。,2019/8/4,35,因子,DNA,RNA,RNA聚合酶,2019/8/4,36,（二） 非依赖 Rho因子的转录终止,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。,RNA产物3端往往形成茎环结构，该结构阻碍RNA聚合酶前移。,茎环结构后有一串寡聚U。寡聚U有利于RNA不再依附DNA模板链而脱出。,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT. 3,DNA,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3,近终止区的转录产物形成发夹(hairpin)结构是非依赖因子终止的普遍现象。,2019/8/4,38,茎环结构使转录终止的机理：,使RNA聚合酶变构，转录停顿； 使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,2019/8/4,39,第三节 真核生物的转录过程 The Process of Transcription in Eukaryote,真核生物的转录过程比原核复杂。二者的转录起始过程有较大区别，转录终止也不相同。,一、 真核生物有三种RNA聚合酶,RNA聚合酶（RNA Pol） RNA聚合酶（RNA Pol） RNA聚合酶（RNA Pol ）,2019/8/4,40,真核生物的RNA聚合酶,酶图,2019/8/4,41,真核生物RNA聚合酶的结构比原核生物复杂，所有真核生物的RNA聚合酶都有两个不同的大亚基和十几个小亚基. RNA聚合酶由12个亚基组成，其最大的亚基称为RBP1。 RNA聚合酶最大亚基的羧基末端有一段共有序列(consensus sequence)为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser的重复序列片段，称为羧基末端结构域(carboxyl-terminal domain, CTD)。 CTD对于维持细胞的活性是必需的。,2019/8/4,42,二、转录起始需要启动子 、RNA聚合酶和转录因子的参与,（一）转录起始前的上游区段具有启动子核心序列,不同物种、不同细胞或不同的基因，转录起始点上游可以有不同的DNA序列，但这些序列都可统称为顺式作用元件(cis-acting element)。,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化 转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。,2019/8/4,43,顺式作用元件：,一个典型的真核生物基因上游序列:,真核生物编码基因两侧的DNA序列，可影响自身基因的表达活性 【DNA分子上具有可影响（调控）转录的各种组分】,2019/8/4,44,顺式作用元件包括启动子、启动子上游元件(upstream promoter elements 或 promoter-proximal elements)等近端调控元件和增强子(enhancer)等远隔序列。 起始点上游多数有共同的TATA序列，称为Hognest盒或TATA盒(TATA box)。通常认为这就是启动子的核心序列。,2019/8/4,45,许多RNA聚合酶II识别的启动子具有保守的共有序列：位于转录起始点附近的起始子(intiator，Inr) 。 启动子上游元件是位于TATA盒上游的DNA序列，多在转录起始点约-40-100nt的位置，比较常见的是GC盒和CAAT盒。 增强子是能够结合特异基因调节蛋白， 促进邻近或远隔特定基因表达的DNA序列。,2019/8/4,46,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-acting element),AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,2019/8/4,47,真核生物RNA聚合酶转录的基因及其转录起始上游序列,2019/8/4,48,（二） 转录因子,能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional factors, TF)。,参与RNA-pol转录的TF,2019/8/4,50,RNA聚合酶II与启动子的结合、启动转录需要多种蛋白质因子的协同作用。 通常包括： 可诱导因子或上游因子与增强子或启动子上游元件的结合； 通用转录因子在启动子处的组装； 辅激活因子和/或中介子在通用转录因子/RNA聚合酶II复合物与可诱导因子、上游因子之间的辅助和中介作用。 因子和因子之间互相辨认、结合，以准确地控制基因是否转录、何时转录。,2019/8/4,51,型基因中的四类转录因子,2019/8/4,52,（三） 转录起始前复合物,真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。 转录起始需形成转录起始前复合物（pre-initiation complex, PIC）。,形成PIC的顺序如下：,由RNA-Pol 催化转录的PIC形成,A,B,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化,2019/8/4,54,PIC的形成与转录,2019/8/4,55,（四）少数几个反式作用因子的搭配启动特定基因的转录（拼板理论）,为了保证转录的准确性，不同基因需不同转录因子。一个基因一般需3至5个转录因子。 拼板理论(piecing theory) ： 几个特定的反式作用因子（主要是可诱导因子和上游因子）之间互相作用，再与基本转录因子、RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。 可诱导因子和上游因子常常通过辅激活因子或中介子与基本转录因子、RNA聚合酶结合，但有时也可直接与基本转录因子、RNA聚合酶结合。,2019/8/4,56,三 、真核生物转录延长过程中没有转录与翻译同步的现象,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。 RNA-pol前移处处都遇上核小体。 转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,2019/8/4,58,四、真核生物的转录终止和加尾修饰同时进行,真核生物的转录终止，是和转录后修饰密切相关的。 真核生物mRNA有聚腺苷酸(poly A)尾巴结构，是转录后才加进去的。 转录不是在poly A的位置上终止，而是超出数百个乃至上千个核苷酸后才停顿。 已发现，在读码框架的下游，常有一组共同序列AATAAA，再下游还有相当多的GT序列。这些序列称为转录终止的修饰点。,2019/8/4,59,转录终止与加尾修饰,2019/8/4,60,第四节 真核生物RNA的加工 Post-transcriptional Modification of Eukaryotic RNA,真核生物转录生成的RNA分子是初级RNA转录物(primary RNA transcript)，几乎所有的初级RNA转录物都要经过加工，才能成为具有功能的成熟的RNA。 加工主要在细胞核中进行。,2019/8/4,61,几种主要的修饰方式：,1. 剪接(splicing),2. 剪切(cleavage),3. 修饰(modification),4. 添加(addition),2019/8/4,62,一、真核生物mRNA的加工包括首、尾修饰和剪接,（一）前体mRNA在5-末端加入“帽”结构,大多数真核mRNA的5-末端有7-甲基鸟嘌呤的帽结构。 这个真核mRNA加工过程的起始步骤由两种酶，加帽酶(capping enzyme)和甲基转移酶(methyltransferase)催化完成。,2019/8/4,63,mRNA的帽子结构（m7GpppG）是在5-端形成的。转录产物第一个核苷酸往往是5-三磷酸鸟苷 pppG。 mRNA成熟过程中，先由磷酸酶把5-pppG水解，生成5-ppG或5-pG。然后， 5-端与另一三磷酸鸟苷（pppG）反应，生成三磷酸双鸟苷。在甲基化酶的作用下，第一或第二个鸟嘌呤碱基发生甲基化，形成帽子结构。,2019/8/4,64,5 pppGp,帽子结构的生成过程：,2019/8/4,65,帽子结构：,2019/8/4,66,帽子结构的意义：,可以使mRNA免遭核酸酶的攻击。（帽子结构是前体mRNA在细胞核内的稳定因素，也是mRNA在细胞质内的稳定因素。） 也能与帽结合蛋白质复合体(cap-binding complex of protein)结合，并参与mRNA和核糖体的结合，启动蛋白质的生物合成。,2019/8/4,67,（二）前体mRNA在3端特异位点断裂并加上多聚腺苷酸尾,尾部修饰是和转录终止同时进行的过程。 poly A的有无与长短，是维持mRNA作为翻译模板的活性，以及增加mRNA本身稳定性的因素。 一般真核生物在胞浆内出现的mRNA，其poly A长度为100至200个核苷酸之间，也有少数例外。 poly A是mRNA由细胞核进入细胞质所必需的。,2019/8/4,68,前体mRNA分子的断裂和加多聚腺苷酸尾是多步骤过程。 加工过程先由核酸外切酶切去3-末端一些过剩的核苷酸，然后由多聚腺苷酸酶催化，以ATP为底物，在mRNA 3-末端逐个加入腺苷酸，形成poly尾。 3-末端切除信号是3-端一段保守序列AAUAAA。,AAUAAA,G/U,5,3,Poly(A)信号,Poly(A)位点,mRNA,CPSF,G/U,5,3,CPSF,CFI,CFII,CStF,CPSF,CStF,CFI,CFII,PAP,CPSF,CStF,CFI,CFII,PAP,ATP,2019/8/4,70,（三）前体mRNA的剪接,1. hnRNA （hetero-nuclear RNA, hnRNA） 核内出现的转录初级产物，分子量往往比在胞浆内出现的成熟mRNA大几倍，甚至数十倍，核内的初级mRNA称为杂化核RNA。,snRNA（small nuclear RNA, snRNA） 核内的小型RNA。碱基数在100300bp范围。snRNA和核内的蛋白质组成小分子核糖核蛋白体（snRNP），作为RNA剪接的场所。,2019/8/4,71,真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。,断裂基因(splite gene),编码区 A、B、C、D,2019/8/4,72,2. 外显子(exon)和内含子(intron),外显子：在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。（结构基因中有表达活性的编码区） 内含子：隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。（结构基因中无表达活性的非编码区）,2019/8/4,73,鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,剪接是把hnRNA中的内含子除去，把外显子连接起来。内含子弯成套索状，称套索RNA（lariat RNA），外显子相互靠近并连接。,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,2019/8/4,75,内含子的分类：,根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类：,I ：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的 rRNA基因； II：发现于线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA； III：是常见的形成套索结构后剪接，大多数mRNA基因有此类内含子； IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。,2019/8/4,76,2019/8/4,77,3. mRNA的剪接 套索剪接模式, 除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。,(1)内含子两端的序列：5GUAG 3 5GU可结合U1-snRNA 分支点A可结合U2-snRNA (2)U1-snRNA, U2-snRNA等形成剪接体（splicesome）将内含子切除,2019/8/4,78,snRNP与hnRNA结合成为剪接体,2019/8/4,79,pG-OH (ppG-OH, pppG-OH),剪接过程的二次转酯反应 (twice transesterification),2019/8/4,81,4. 剪切和剪接，可加工成不同的mRNA,剪切：剪去内含子后，上游的外显子不再与相邻的外显子连接。 剪接：剪去内含子后，上游的外显子继续与相邻的外显子连接。（即剪切后将相邻的外显子连接