课件：年制骨髓检查实验.ppt

骨髓检查（实验）,中南大学湘雅医院血液科血液学研究室 张国平,血液学实验诊断的临床应用范围,临床血液病包括 白细胞系列疾病： 红细胞系列疾病： 急、慢性白血病 各种增生性贫血 其它慢性骨髓增殖性疾病 增生不良性贫血 淋巴瘤 恶性组织细胞病 各种继发性贫血疾病 粒细胞缺乏、造血停滞 等 浆细胞疾病如： 血小板疾病： 多发性骨髓瘤 血小板减少性疾病 巨球蛋白血症 血小板增多性疾病 意义不明球蛋白增多 等 血小板功能缺失性疾病 等 止血与血栓范畴疾病： 其它： 血友病 脾功能亢进 抗凝血因子血症（继发性） 类白血病反应 弥散性血管内凝血（DIC ） 等 其它继发性血液学改变 等,实验血液学的概念与内容,实验血液学 是以血液及造血组织为研究对象，采用基础医学的多种研究技术，建立血液系统疾病的实 验室诊断标准，并检测其它临床诸学科疾病的血液学指标改变，为血液病及继发性血液病 的诊断、鉴别诊断及治疗提供依据。 MICMC联合诊断技术包括： 血细胞形态学检查-M morphology test 免疫学分型（流式术）-I-immunity test 染色体检查-C-chromosome test 分子生物学检查-M-molecular biology test 临床资料-C-clinical material 贫血疾病检验技术 细胞生物学、免疫学、生物化学 止血与血栓检验 免疫学、生物化学,血液学MICM联合诊断的任务,早期诊断 骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤前期、贫血性疾病早期 诊断 急慢性白血病、慢性骨髓增殖性疾病、浆细胞系列疾病、贫血性疾病 血小板相关疾病 、淋巴增殖性疾病、组织细胞疾病 鉴别诊断 白血病与类白血病反应 多发性骨髓瘤与反应性浆细胞增多； 巨幼贫血与骨髓增生异常综合征； 慢性嗜酸性粒细胞白血病与继法性嗜酸性粒细胞增多； 预后判断 BCR/ABL存在表明急性白血病的耐药，等等 治疗靶点检测 PML/RAR 是维甲酸靶向治疗靶点 BCR/ABL 是格力威靶向治疗靶点 CD20 是美罗华靶向治疗靶点,实验血液学发展的金字塔,分子血液 流式及染色体分析 细胞形态学、细胞化学、临床资料,（一）血液学临床检验常用分析技术,血细胞形态学（M）:morphology 包括血液、骨髓细胞形态学,人类血细胞增殖与分化图,原始细胞20%为急性白血病 线下为慢性白血病或类白反应,1）红细胞系统,(erythron),胞体由大变小,始终呈圆形,核保持圆形，渐缩小，固缩，后脱核，成熟红细胞无 核;染色质结构由细致疏松逐渐变为紧密粗糙. 核仁由清晰到消失,浆由深蓝或浅蓝变为浅红由少渐多,2）粒细胞系统,胞体由大变小早幼粒细胞可比原粒细胞稍大圆形或椭圆形,粒系胞核一侧渐凹陷，后成分叶状染色质结构由细致疏松逐渐变为紧密粗糙核仁由清晰到消失,由嗜碱变为嗜酸,颗粒由无到有,(granulocytes),3）淋巴细胞系统(lymphocytes),胞体保持圆形或椭圆形,核呈圆或椭圆形，染色质结构由 细致疏松逐渐变为紧密粗糙，核仁由清晰到消失,胞质透明天蓝，颗粒少,4）单核细胞系统（monocytes）,胞体变为不规则形,核变为一侧凹陷，后成肾形，不规则形，有扭曲折叠染色质结构由细致疏松逐渐变为紧密粗糙， 核仁由清晰到消失,单核系呈浅灰蓝,颗粒由无到有,5）浆细胞(plasmacytes),由圆形变为卵圆形,核保持圆形,胞质由浅灰蓝变为深蓝,6）巨核细胞系统 (megakaryocytes),正常骨髓细胞形态1,正常骨髓细胞形态2,正常骨髓细胞形态 3,骨髓细胞形态学检查的内容、步骤和方法,1）低倍镜下观察内容： 1确定标本的取材和涂片是否满意。 Tell the material and the smear is good or not 2判断骨髓增生程度：观察有核细胞与成熟红之间比例，增生程度共分五级： Tell the degree of bone marrow proliferation 2）油镜下观察内容 1.骨髓片分类计数 2.观察特殊细胞化学染色片 3.血片分类计数 4.网织红片计数（煌焦油蓝与血液混合液制片） 3）结合临床，并在有必要时结合免疫学分型（I）、细胞遗传学诊断（I）和分子生物学诊断(M)作出诊断报告,Contents and Methods,4.确定标本的取材和涂片是否满意,标本的取材：应结合骨髓穿刺实况、血常规和临床情况判断，取材稀释时应重抽。 涂片的规格：应有头、体、尾，要均匀。,5、判断骨髓增生程度,共分5级： 1.增生极度活跃(excessive overactivity) 2.增生明显活跃(obvious activity) 3.增生活跃(activity) 4.增生减低(reductive activity) 5.增生明显减低(obvious reduction),增生极度活跃 (excessive overactivity),有核细胞：成熟红细胞 1 ：1,100 倍,增生明显活跃 (obvious activity),有核细胞：成熟红细胞 1 ：10,100 倍,增生活跃 (activity),有核细胞：成熟红细胞 1 ：20,100 倍,增生减低 (reductive activity),有核细胞：成熟红细胞 1 ：50,100 倍,增生明显减低 (obvious reduction),有核细胞：成熟红细胞 1 ：200,100 倍,骨髓增生程度 (degree of proliferation),100 倍,（1）增生极度活跃，常见于急、慢性白血病 excessive overactivity: acute lymphocytic leukemia etc. （2）增生明显活跃，常见于各种增生性贫血、ITP、脾亢及正常儿童和青年。 obvious activity: various anemia with bone marrow proliferation; leukemia; ITP; hypersplenia ; and normal children or young people （3）增生活跃，正常人及部分再障伴局灶性代偿性增生者。 Activity: normal people and some patients with aplastic anemia and Compensatory hyperplasia sites.,6、骨髓增生程度的临床意义,（4）增生减低：常见于慢性再障、骨髓纤维化（Myelofibrosis）、粒细胞缺乏及老年人。 reductive activity: chronic aplastic amenia; agranulocytosis；Myelofibrosis and old people （5）增生明显减低：急性再障、骨髓坏死。 obvious reduction:acute plastic anemia; bone marrow necrosis,7、细胞化学染色,细胞化学染色可弥补细胞形态学的不足 主要包括： 过氧化物酶染色 铁染色 酯酶染色及NaF抑制实验 中性粒细胞碱性磷酸酶染色,铁染色,过氧化物酶染色,8. 观察巨核细胞的数目,9.血涂片的观察(Blood Smear),计数100个白细胞, 注意形态(morphology)及有无幼稚细胞(immature cell). 成熟红细胞形态有无异常,有无幼稚红细胞(immature erythrocyte). 估计血小板数量及有无形态异常. 有无寄生虫如疟原虫(plasmodium).,（二）免疫流式细胞分析,流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量,光信号检测 散射光信号,Right Angle Light Detector Cell Complexity SSC,Forward Light Detector Cell Surface Area FSC,Incident Light Source,前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC, Side Scatter） 细胞粒度及细胞内相对复杂性,Laser,FALS Sensor,鞘流系统 流动室,鞘液,荧光信号,双色直接染色,2019/8/4,37,可编辑,外周全血细胞散射光双参数点图 （红细胞溶解后）,流式细胞术-正常人骨髓有核细胞免疫表型散点图,M3 骨髓细胞免疫分型散点图,急性早幼粒细胞白血病（AML-M3）骨髓细胞免疫分型散点图,（三）染色体分析（C）,非显带时期(70s前) 显带时期(70s),R带,G带,Q带,C带,高分辨显带,染色体异常数目改变,三倍体 和 四倍体 非整倍体 +21, +18, +13, XXY, 等,染色体异常结构异常,平衡改变 易位和 倒位 不平衡改变 缺失, 扩增, 环状染色体, 和等臂染色体,典型t(9;22)(q34;q11),（四）分子生物学技术（M）,PCR/FISH技术 实验血液学较早地将分子物物学引入临床诊断 检测BCR/ABL、PML-RARa、AML/ETO、和DEK-CAN融合基因 荧光实时定量PCR技术则为有特定融合基因的白血病亚型的残存瘤细胞的检测带来希望。敏感度高达10-5。 湘雅医院血液研究室分子生物实验室在分子血液病检测方面已经积累了相当经验。,白血病及淋巴瘤中常见的基因改变,慢粒白血病BCR/ABL残留检测 慢性淋巴白血病 FISH检测图示：Igh重排,举例几种血液病MICMC特征,急性白血病的MICMC分型(WHO)-形态学(M),骨髓或外周血中原始细胞比值 20% 1、急性非淋巴细胞白血病:共九型 M0:原始血细胞30%, POX染色- M1:原始粒细胞90%,POX染色+或- M2:原始粒细胞90% ,POX染色+ M3:异常早幼粒细胞30%,POX染色+ M4:粒-单核混合白血病, POX染色+ M5:原始单核细胞+幼稚单核细胞30%, POX染色+ 或- M6:红白血病, 原始红细胞等增多,POX 染色+ M7:巨核细胞白血病,原始巨核细胞30%, POX染色- 急性髓系白血病: 30% 髓系原始细胞20%,急性白血病的MICMC分型(WHO)-形态学(M),2、急性淋巴细胞白血病:共三型 原始淋巴细胞+幼稚淋巴细胞20% L1:以小淋巴细胞为主 L2:以大淋巴细胞为主 POX染色为- L3:以胞浆充满空泡的 淋巴细胞为主 缺点:POX染色阴性者单以细胞形态难区别，分型准确率78%,急性白血病的MICMC分型(WHO)-免疫学(I),流式细胞术分析细胞免疫表型(血细胞簇分化抗原CD分子） ANLL常用 CD分子阳性的: CD13、CD14、 CD33、CD34 其中M7型白血病(巨核)标志性CD分子: CD41/CD42 ALL常用 CD分子阳性的: T-ALL:CD3、CD7 B-ALL:CD19、CD20,急性T淋巴细胞白血病（T-ALL） 骨髓细胞免疫分型散点图,急性早幼粒细胞白血病（AML-M3）骨髓细胞免疫分型散点图,急性白血病的MICMC分型(WHO)遗传学(C),M3型白血病:t(15;17)(q22;q11-12) 还有一些出现在ANLL中的染色体变异 如:t(8;21)(q22;q22) t(6;9)(p23;q34) t(9;11)(p21;q23) inv(3) 超、多倍体等 ALL白血病: t(1;19) t(4;11) t(8;14) t(9;22) 超、多倍体等,急性白血病的MICMC分型(WHO)分子生物学(M),FISH技术 定性检测 BCR/ABL PML-RARa AML1-ETO DEK-CAN等 Q-PCR技术 定量检测 BCR/ABL PML-RARa AML1-ETO DEK-CAN等,慢性白血病的MICMC分型(WHO)-形态学(M),慢性粒细胞白血病 血常规：白细胞显著升高，以中性中晚幼粒增多为主。 骨髓象：增生极度活跃，原始粒细胞比值轻至中度升高（20%），但以中性中晚幼粒显著增生为主。 慢性淋巴细胞白血病 血常规：白细胞显著升高，以成熟淋巴细胞增多为主 骨髓象：增生明显活跃，原始及幼稚淋巴细胞轻度增多，以以成熟淋巴细胞增多为主,慢性白血病的MICMC分型(WHO)-免疫学(I),慢性粒细胞白血病 一般不需流式检测 慢性淋巴细胞白血病 可为不典型慢性淋巴细胞白血病的诊断提供询证。,慢性白血病的MICMC分型(WHO)遗传学(C),慢性粒细胞白血病 标志性染色体变异：t(9;22)(q34;q11)， 为酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼STI571的治疗靶点。它通过与ATP竟争ABL上结合靶点，使BCR/ABL酪氨酸激酶失活。 这也是伊马替尼治疗其它肿瘤如：肺癌、乳腺癌、肠间壁瘤的药理。 慢性淋巴细胞白血病 慢性淋巴细胞白血病的一些染色体变异与预后相关。,慢性白血病的MICMC分型(WHO)分子生物学(M),慢性粒细胞白血病 Q-PCR可定量检测BCR/ABL的拷贝数。有助于诊断，也有助于治疗或移植后残存肿瘤细胞的检测。 慢性淋巴细胞白血病 如IGH、P53、ATM的重排检测，可有助于诊断及预后判断。 特别是FISH技术检测慢粒的BCR/ABL，慢淋的IGH、P53、ATM的变异有快速的优势。,实验血液学在贫血性疾病诊断中的应用,常用技术也包括： 血液及骨髓细胞形态学(M) 流式细胞术(I) 染色体检验(C) FISH技术、PCR技术(M) 贫血检测相关技术 临床表现 (C),贫血性疾病中细胞形态学(M)检验的应用(1),增生性贫血： 血常规：以Hb减低为主 骨髓象：以中、晚幼红细胞代偿 增生为主要表现 营养性 缺铁性贫血-小细胞+低色素 贫血 巨幼细胞性贫血-大细胞+正色素 急性失血性贫血-正细胞+正色素 自身免疫性溶贫-正细胞+正色素 异常血红蛋白病-正细胞+正色素 溶 蚕豆病-正细胞+正色素 血 阵发性睡眠性血红-正细胞+正色