课件：第六章：蛋白质的分离纯化和表征.ppt

第六章 蛋白质的分离纯化和表征,重点： 一、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 二、蛋白质的分离纯化方法 三、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 难点： 蛋白质分子量的测定,第一节：蛋白质的酸碱性质 1两性解离 蛋白质分子中有很多酸性解离基团和碱性解离基团，是具有两性解离性质的化合物。 各种解离基团的解离度与溶液的pH有关，pH越低，碱性解离度越大，蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少；pH升高，则解离情况相反。,2等电点 调节溶液的pH可以改变蛋白质分子的带电状况。在特定pH条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷相等，静电荷为零，这一pH 称为该蛋白质的等电点（pI）。等电pH并不是一个恒定的值，它会因溶液中盐的种类和离子强度的影响而有所不同。 等离子点 蛋白质在纯水溶液中的带电状态则没有其他离子干扰，完全由H+的解离和结合来决定，这种条件下的等电点称为等离子点。等离子点是蛋白质的特征性常数。,3等电沉淀和蛋白电泳 等电沉淀技术：在等电点pH条件下，蛋白质为电中性，比较稳定。其物理性质如导电性、溶解度、黏度、渗透压等都表现为最低值，易发生絮结沉淀。因此，等电点性质常被用于蛋白质的分离制备，被称为等电点沉淀技术。 电泳：带电颗粒在电场中泳动的现象称为电泳。 蛋白电泳：溶液pH值不等于等电点； 直流电场。用于蛋白质的分离和纯化。,双向电泳（two-dimensional electrophoresis） 如果将等电聚焦电泳与SDS-PAGE结合起来，就是分辨率更高的一种双向电泳了（下图）。双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。,一化学测定法 首先利用化学分析方法测定蛋白质中某一特殊成分（某种元素或某种氨基酸）的百分含量。然后，假定蛋白质分子中该元素只有一个原子（或一分子某种氨基酸），据其百分含量可计算出最低相对分子质量： 最小相对分子质量=已知成分的相对分子质量（或相对原子质量）/已知成分的百分含量100。例如：测得铁的百分含量为a,则该蛋白的最低相对分子质量为：a/铁的相对原子质量,第二节：蛋白质相对分子质量的测定,二凝胶过滤法,凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。 单个凝胶珠本身象个“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。 原理：当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。 凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。,大小不同的蛋白质分子可以通过凝胶过滤分开。在一定的条件下，被分离的蛋白质的分子量的对数与其洗脱体积成比例，所以常利用这一原理进行天然蛋白质分子量的测定。,三SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法 SDS：烷基十二酯硫酸纳，变性剂。,1.定义：电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresis）。 凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）。一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关，我们介绍其中常用的几种主要的电泳技术。,在聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上，人们又发展了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用含有一种去污剂十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸35分钟），使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时破坏二硫键（使二硫键还原）。经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。 由于SDS是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS，大的蛋白质按比率可以结合更多的SDS。所有结合SDS的蛋白质-SDS复合物的形状近似于长的椭圆棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成比例。 电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。SDS-PAGE中，去污剂既要加到凝胶介质中，也要加到电极液中，以便维持处理过的蛋白质样品的变性状态。,2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理,3.SDS-PAGE测未知蛋白质分子量,蛋白质在各种介质中（PAGE）电泳时，它的迁移率,这样造成两个后果： SDS为阴离子，多肽链覆盖上相同密度的负电荷超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。 因此，所有SDS-蛋白质复合物，电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极移 动。 改变了蛋白质单体分子的构象。 SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。,电泳相对迁移率（R）=蛋白质分子泳动的距离/原点到前沿的距离 电泳相对迁移率（R）与标准蛋白相对分子质量的对数作图得标准曲线 根据未知相对分子质量的R可从图上查得相对分子质量。 优点：快速，用量少，一次实验可同时测多个样品。缺点是误差大。 这种方法只能测得亚单位肽链的相对分子质量。,四超离心沉淀速度法,五渗透压法测定相对分子质量,一蛋白质的胶体性质 1蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质是生物大分子相对分子量一般都在1-100万Da之间，其颗粒大小属于胶体粒子的范围。又由于其分子表面有许多极性基团，亲水性极强，易溶于水成为稳定的亲水胶体溶液。 蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个因素：双电层和水化层；,第三节：蛋白质的胶体性质和沉淀,3.分散相质点在胶体系统中保持稳定需三个条件： a 分散相质点1-100nm b 分散相质点带有同种电荷，互相排斥不聚成颗粒而沉淀 c 分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层,二蛋白质的变性作用,1.定义：在某些物理或化学因素作用下，天然蛋白质严密的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失（如酶失去催化活力，激素丧失活性），则称之为蛋白质变性作用。 一般认为蛋白质变性本质是次级键的破坏，只有空间构象的改变，并不涉及一级结构（共价键）的变化。,2019/8/5,25,可编辑,2.引起变性的因素： 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐、生物碱试剂、尿素等 物理因素：加热、射线、超声波、剧烈震荡等,旋光值改变； 特性粘度增加； 溶解度降低； 扩散系数降低； 结晶能力丧失； 易于沉淀，若加热还会凝固。但若远离等电点则不一定沉淀； 变性后蛋白质肽键暴露而更加易于消化,3.变性后蛋白质的表现：,4.变性蛋白的复性 有些变性程度较轻的蛋白质经去除变性因素后，可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。这种变性称为可逆变性。 但许多蛋白质变性后并不能复性，称为不可逆变性。,三.蛋白质的沉淀：,1概念 蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。假若改变环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮结沉淀现象，这既是所谓的蛋白质沉淀作用。,2. 沉淀蛋白质的方法： 盐析法：中性盐（NH4SO4，NaSO4，Nacl等） 蛋白质脱去水化层 优点：不引起蛋白质变性 有机溶剂沉淀法： 极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）脱去水化层以及降低介电常数 而增加带电质点间的相互作用 条件：低温操作，缩短时间 重金属盐沉淀法 当溶液PHPI,蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子(Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)生成沉淀 用途：抢救误服重金属盐的病人 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 生物碱试剂_能引起生物碱沉淀的一类试剂 当溶液PHPI时,蛋白质颗粒带正电荷 易与生物碱试剂,酸根负离子反应沉淀 用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质,四蛋白质的颜色反应 1.双缩脲反应 双缩脲是两分子尿素经加热脱氨缩合生成的产物，两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成粉红色的复合物双缩脲铜纳氢氧化物。这一呈色反应称为双缩脲反应。 一切蛋白质和两个肽键以上的多肽化合物都具有双缩脲反应。肽链越长显色越深，由粉红、紫红直到蓝紫色。,2.酚试剂反应（Folin酚试剂） 酪氨酸、色氨酸还原磷钼酸、磷钨酸为蓝色化合物 微克水平 3.黄色反应 含有酪氨酸、色氨酸的蛋白质的特有反应 蛋白质溶液加入硝酸，产生白色沉淀，加热变成黄色沉淀。硝基苯衍生物 4.乙醛酸反应 蛋白质溶液加入乙醛酸，沿管壁慢慢加入浓硫酸，两相液面出现紫色环 色氨酸、含有色氨酸的蛋白,五蛋白质的紫外吸收性质 一般蛋白质在280nm波长处都有最大的吸收率，这是由于蛋白质中有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故。 所有的蛋白对小于230nm波长的光波都有强烈的吸收。这是肽键的属性。,第四节：蛋白质分离和纯化,一蛋白质分离纯化的一般原则,蛋白质提纯的总目标-增加制品纯度或比活性、即增加单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或生物活性,1. 前处理：,二蛋白质的分离纯化方法 纯化蛋白质要根据蛋白质在溶液中的下列性质：分子大小、溶解度、电荷、吸附性质、对配体的生物学亲和力。 1根据分子大小不同的纯化方法 1）透析和超过滤,透析：是利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。半透膜常用的有玻璃纸（又称赛璐玢纸）和火绵纸（塞璐碇纸）及其他改型的纤维素材料。,超过滤：是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质分子被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。切向流过滤。,超过滤装置,2）密度梯度离心 蔗糖梯度，氯化铯梯度。 3）凝胶过滤 凝胶珠：交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel P)和琼脂糖(Sepharose)。 排阻极限：不能扩散进入凝胶珠微孔的最小分子的Mr。孔径越大，排阻极限越高。 原理：Vt = V0+Vi+Vm Ve为某一溶质组分的洗脱体积；,2利用溶解度差别的纯化方法 影响蛋白质溶解度的外部因素很多，其中主要有：溶液的pH、离子强度、介电常数和温度。溶解度归根结底取决于他们本身的分子结构。 1）等电点和pH值控制 2）蛋白质的盐溶和盐析 盐溶：中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。 离子强度：I = 1/2ciZi ci为各种离子的浓度 Zi为各种离子的静电荷。 盐析：当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析。,3）有机溶剂分级分离法 引起蛋白质沉淀的主要原因是改变了介质的介电常数。 4）温度对蛋白质溶解度的影响 0-40之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度的升高而增加。,3根据电荷不同的纯化方法 1）电泳 在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。 从方法学上，电泳是在外电场存在下，利用分子携带的静电荷不同以分离混合物的一种实验技术。带电颗粒在外电场中发生泳动时，将受到两种方向相反的力的作用。 F(电场力)=qE=qU/S；Ff(摩擦力)= fv E 电场强度或电势梯度；U 两极间的电势差；S 两极间的距离 f 摩擦系数（与颗粒的形状、大小和介质的黏度有关） v 颗粒泳动速度 当颗粒以恒定速度移动时： F = Ff qE = fv v/E =q/f 在一定的介质中对某一蛋白质来说q/f是一个定值，因而v/E也是一定值，它被称为电泳迁移率或泳动度。=v/E 经典的自由电泳或称为移动界面电泳。,2）聚丙