课件：氨基酸2013.ppt

氨基酸(amino acids),一、蛋白质的水解,碱水解会降低蛋白质的营养价值,A. 胰蛋白酶( trypsin ) 专一裂解Lys、Arg的羧基参与形成的肽键（后为Pro时抑制）。为了减少的作用位点，可用化学修饰将多肽链侧链保护起来，1.2-环己酮封闭Arg，马来酸酐封闭Lys。氮丙啶形成带正电荷点，增加位点。 B. 糜蛋白酶(Chymotrypsin) 断裂Phe,Trp,Tyr等疏水AA的羧基所形成的肽键。后为Pro时抑制 C.胃蛋白酶(Pepsin)（在Leu,Phe,Trp,Tyr后） 断裂键两侧的殘基都是疏水性或芳香氨基酸残基。其后和前为Pro时抑制。,酶解法（内切酶）,（Pro不能测）,(1).羧肽酶(carboxypeptidase)法，（Pro不能测）,Carboxypeptidase A recognizes all aas except Arg/Lys/Pro; Rn-1 cannot be Pro Carboxypeptidase B recognizes Arg/Lys; Rn-1 cannot be Pro,酶解法（外切酶）,1、不同氨基酸的R基不同，R基决定了氨基酸的性质 2、兼性离子晶体溶点高离子晶格，不是分子晶格。 3、溶解性：一般都溶于水，不溶或微溶于醇 4、介电常数高水溶液中的氨基酸是极性分子。,二、 氨基酸的一般结构,蛋白质氨基酸,非蛋白质氨基酸,基本氨基酸：具有密码子,不常见的蛋白质氨基酸,氨基酸,三、氨基酸的分类,1、基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸）：组成蛋白质， 20种，又称为天然氨基酸、常见的蛋白质氨基酸） 2、稀有氨基酸：是多肽合成后由基本aa经酶促修饰而来。 3、非蛋白质氨基酸：存在于生物体内但不组成蛋白质 (约150种)。,基本氨基酸的分类-方式1,按R基结构分类,Aliphatic Amino Acids,Aromatic Amino Acids,一氨基一羧基的氨基酸 Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Ser.Thr,Cys,Met 一氨基二羧基的氨基酸（酸性氨基 酸）及酰胺:Asp,Glu.Asn,Gln 二氨基一羧基的氨基酸（碱性氨 基酸）:Arg,Lys,(1) 脂肪族氨基酸,(2) 芳香族氨基酸: Phe,Tyr,Trp,(3) 杂环族氨基酸：His,Pro,（1）侧链为烃链的氨基酸,丙氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 缬氨酸 甘氨酸,R基均为中性烷基，R基对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点。从Gly至Ile，R基团疏水性增加 Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，不具旋光性，Gly的侧链介于极性与非极性之间，也把它归为非极性类。,（2）. 侧链含有羟基的氨基酸 （2种）,丝氨酸 苏氨酸,Ser的-CH2 OH基（pKa=15）在生理条件下不解离，但在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基存在。 Ser和Thr的-OH往往与糖链相连，形成糖蛋白。,（3）.侧链含硫原子的氨基酸,Cys的R中含巯基（-SH） 两个Cys的巯基氧化可以生成二硫键，生成胱氨酸。 Met在生物合成中是一种重要的甲基供体，蛋白质合成的第一个氨基酸。,蛋氨酸 半胱氨酸,Sulfur Containing Amino Acids,两个半胱氨酸氧化可以形成胱氨酸,（4） 侧链含有羧基或酰胺基的氨基酸（4种）,天冬氨酸 侧链为-羧基,谷氨酸 侧链为-羧基,天冬酰胺,谷氨酰胺,Asp 和Glu它们是唯一在生理条件下带有负电荷的的两个 氨基酸,（5）. 侧链含有碱性基团的氨基酸（3种）,组氨酸 赖氨酸 精氨酸 侧链有咪唑环 侧链有-氨基 侧链有胍基,它们是唯一在生理条件下带有正电荷的的三个 氨基酸,碱性氨基酸,Lys侧链氨基的pKa为10.53，生理条件下，Lys侧链带有一个正电荷（NH3+），侧链的氨基反应活性增大。胶原蛋白中的Lys侧链氧化时能形成很强的分子间(内)交联。 Arg是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，pKa值为12.48，生理条件下完全质子化。与NaOH相当 His是pKa值最接近生理pH值的一种（游离氨基酸中为6.00，在多肽链中为7.35 ） ，是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。His在酶的酸碱催化机制中起重要作用。它往往存在于许多酶的活性中心。,Basic Amino Acids,组蛋白中较多,乙酰-CoA羧化酶的组成,上面的生物素辅基象一个摆臂,(6)、R为芳香族基团的氨基酸（3种）,Aromatic Amino Acids,R为芳香族基团的氨基酸,三种芳香族氨基酸在紫外光区都吸收紫外光，在中性pH条件下，色氨酸和酪氨酸的紫外吸收峰在280nm，而苯丙氨酸的在260nm，大多数蛋白质中都含有色氨酸和酪氨酸或其中的一种，所以溶液中280nm吸收的测量常用来估算蛋白质的浓度。也与蛋白质发荧光有关,(7) 杂环氨基酸：脯氨酸,一种亚氨酸，具有固定的构型,Pro的-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。 一般出现在两段-螺旋之间的转角处，Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化，,甘、丙、缬、亮、异亮 丝、苏、半胱、蛋、 天冬、谷、赖、精 苯丙、酪、色、组、脯,基本氨基酸结构特点小结,支链氨基酸：缬氨酸、亮氨酸，异亮氨酸 含羟基的氨基酸：丝氨酸、苏氨酸 含硫的氨基酸：半胱氨酸（含巯基）、 甲硫氨酸（含硫甲基） 含苯环的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸 含胍基的氨基酸：精氨酸 含咪唑基的氨基酸：组氨酸 亚氨基酸：脯氨酸 含酰胺的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺 含吲哚基的氨基酸：色氨酸 含-氨基的氨基酸：赖氨酸,按侧链R基极性分类,基本氨基酸的分类-方式2,（1）不带电荷的极性R基的aa：丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸， 半胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺 （2）带正电荷的极性R基aa（碱性aa）：赖氨酸， 精氨酸， 组氨酸 （3）带负电荷的极性R基aa（酸性aa）：天冬氨酸，谷氨酸,1. 非极性R基氨基酸，侧链无极性,甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸、脯氨酸，,2. 极性R基氨基酸,1. nonpolar (hydrophobic) amino acids.,2. Polar Uncharged Amino Acids,组氨酸 赖氨酸 精氨酸 侧链有咪唑环 侧链有-氨基 侧链有胍基,3. Positively charged at physiological pH,Positively charged at physiological pH,R groups have one -NH2. Amino Acids with “Basic” Side Chains R groups are positively charged at neutral pH (=7.0). AAs are highly hydrophilic.,4. Amino acids with acidic side chains,The acidic amino acids,R groups have COOH. Amino Acids with Acidic Side Chains R groups are negatively charged at physiological pH (=7.4). AAs are soluble in H2O.,天冬氨酸 侧链为-羧基,谷氨酸 侧链为-羧基,Aspartic acid glutamic acid (Asp or D) (Glu or E),R-Groups,氨基酸的亲疏水性指数,极性与非极性与蛋白质空间结构形成密切相关,非极性aa一般形成蛋白质的疏水核心，带电荷的aa和极性aa位于表面。,Protein structure,Non-polar groups do not interact with water Polar groups readily interact with water,氨基酸的疏水性和蛋白质三维结构,思考：假设该序列只是大的球蛋白的一部分，下面氨基酸残基中哪些可能分布在蛋白的外表面，哪些分布在内部？ 天冬氨酸；异亮氨酸；苏氨酸；缬氨酸；谷氨酰胺； 赖氨酸,分析：分布在外表面的为极性和带电荷的残基：Asp、Gln和Lys；分布在内部的是非极性的氨基酸残基：Try、Leu和Val；Thr尽管有极性，但疏水性也很强，因此，它出现在外表面和内部的可能性都有。,氨基酸的疏水性和蛋白质三维结构,思考： 有一个蛋白质分子在pH7的水溶液中可以折叠成球状，通常是带极性侧链的氨基酸位于分子外部，带非极性侧链的氨基酸位于分子内部。请回答： （1）在Val、Pro、Phe、Asp、Lys、Ile和His中，哪些位于分子内部，哪些位于分子外部？ （2）为什么在球蛋白内部和外部都能发现Gly和Ala？ （3）Ser、Thr、Asn和Gln都是极性氨基酸，为什么会在分子内部发现？ （4）在球蛋白的分子内部和外部都能找到Gys，为什么？,氨基酸的疏水性和蛋白质三维结构,分析：（1）Val、Pro、Phe、Ile是带有非极性测链的氨基酸，这些氨基酸残基位于分子内部 ；Asp、Lys、His是带有极性侧键的氨基酸，这些氨基酸残基位于分子的外部。 （2）因为Ala和Gly两者的侧链都比较小，疏水性和极性都小；Gly只有一个H与碳原子相连，Ala只有CH3与碳原子相连，故它们既可以出现在分子内部，也可以出现在分子外部。 （3）Ser、Thr、Asn、Gln在 pH 7.0时含有不带电荷的极性侧链，参与分子内部的氢键形成，从而减少了它们的极性，故会在分子内部发现。 （4）因为Cys属于不带电荷的极性氨基酸，可位于分子外部，但又由于Cys常常参与链内和链间的二硫键形成，使其极性减弱（少），,Folding proceeds via intermediate steps, forming molten globule which is refined to minimum energy (native) state Free energy difference between folded and unfolded structure is 42 kJ/mole (about the same as 1.5 ATP) Because folding is cooperative, once a protein begins to fold or unfold, the entire process is completed quickly. 维持蛋白质三维结构或DNA 双螺旋最稳定的因素是（？）,疏水作用与蛋白质折叠,基本氨基酸的分类-方式3,Essential/Non-Essential Amino Acids,按氨基酸是否能在人体内合成分： （1）必需氨基酸：指人体内不能合成的氨基酸，必须从食物 中摄取，有八种：Lys,赖氨酸、Trp,色氨酸、Met甲硫氨酸、 Met 苯丙氨酸、Val 缬氨酸、Leu亮氨酸、Ile异亮氨酸、Thr 苏氨酸。（携一两本淡色书来） （2）非必需氨基酸：指人体内可以合成的氨基酸。有十种。 （3）半必需氨基酸：指人体内可以合成但合成量不能满足人 体需要（特别是婴幼儿时期）的氨基酸，有两种：组氨酸 (His)、精氨酸(Arg)。,Other amino acid derivative I,21st & 22nd AAs,含硒半胱氨酸只存在于含硒蛋白之中，而吡咯赖氨酸仅存在于一些真细菌和古细菌体内，作为与产甲烷代谢有关的某些酶的组分。,基本氨基酸其他分类方式,1、参与尿素合成的基本氨基酸： 精氨酸、天冬氨酸,基本氨基酸其他分类方式,3、 产生一碳单位： 甘氨酸、丝氨酸、组氨酸、色氨酸，蛋氨酸,2. 转变成糖或脂肪 生糖氨基酸 生酮氨基酸：亮氨酸、赖氨酸 生糖兼生酮氨基酸： 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、异亮氨酸,4、糖代谢产物直接转氨基产生的氨基酸： 丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸（也可还原产生）,基本氨基酸其他分类方式,5、血液中转运氨的氨基酸:谷氨酰胺和丙氨酸 6、不能直接转氨基的氨基酸：Gly、Lys、Thr、Pro 7、蛋白质中的荧光主要来自： 酪氨酸和色氨酸 8、参与核苷酸合成的氨基酸,基本氨基酸其他分类方式,9、蛋白质中参与结合金属离子的氨基酸： 半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸,羧肽酶A,2、不常见蛋白质氨基酸,也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来, 胱氨酸（Cystine) 广泛地存在于蛋白质中。它由两个半胱氨酸的巯基氧化之后形成的，形成二硫键。,不常见蛋白质氨基酸及非蛋白质氨基酸,：存在于生物体内，但不组成蛋白质的呈游离或结合态的氨基酸，约150种，具有多种生理功能。 （1） L-氨基酸的衍生物 L-瓜氨酸和L-鸟氨酸是合成精氨酸的中间产物。 （2）D-氨基酸 D-Ala存在于肽聚糖中，D-Phe是短杆菌肽S的组分 （3）、-氨基酸 -Ala是泛酸的前体，-氨基丁酸是传递神经冲动 的化学介质。,3、非蛋白质氨基酸,真核生物中的D型氨基酸,1990年以后陆续发现哺乳动物体内大量存在D-Ser, D-Asn。D-Ser在大脑前叶中与谷氨酸受体 (NMDA受体) 的分布一致，能激活NMDA受体，与学习记忆有关。而D-Asn则在大鼠的所有组织中都有分布，可能与成熟有关。,四、氨基酸的酸碱性质,（一）、氨基酸的兼性离子形式 兼性(两性)离子：指在同一分子上带有能释放质子的正离子基团和能接受质子的负离子基团。兼性离子本身既是酸又是碱。因此它既可以和酸反应，也可以和碱反应。,晶体溶点高 离子晶格，不是分子晶格。不溶于非极性溶剂 极性分子。介电常数高 水溶液中的氨基酸是极性分子,triprotic,triprotic,diprotic,at low pH, Amino acids can be diprotic acids, or even triprotic acids if their R groups are ionizable. (have one dissociable H+).,（二）氨基酸的解离,每个氨基酸所带电荷 ？,完全质子化的氨基酸可以看成二元酸或三元酸,氨基酸的解离,零电荷,氨基后解离,羧基先解离,酸性环境 中性环境 碱性环境,氨基酸解离集团的解离有顺序，不同解离集团解离过程中的电荷变化？,甘氨酸的解离曲线,pKa值,pKa值,正电荷越？,负电荷越？,氨基酸的解离- pKa值,(1)、-COOH(羧基) pK值在2.0左右，当pH3.5， -COOH以-COO- 形式存在。 (2) -2（氨基）pK值在9.4左右，当pH8.0时， -2以-3+ 形式存在。,pKa值就是指某种解离基团有一半解离时的pH值,pK值的大小可以表示解离基团酸性的强弱,pK值小则酸性强。 在pKa时缓冲能力最强,COOH COOH + COO-,氨基酸解离的PKa,His 是唯一具有近中性pKa 基团(imidazole) 的氨基酸,氨基酸氨基和羧基的解离和PKa值,当溶液的pH值在3.5-8.0范围内时，氨基酸是两性离子（偶极离子）存在,为什么?,熔点：氨基酸的熔点一般都比较高，一般都大于200， 超过熔点以上氨基酸分解产生胺和二氧化碳。,Titrations of polyprotic amino acids,Titration of glutamic acid,three stages (three ionization steps three pka values),Titrations of polyprotic amino acids,Titration of lysine.,three stages (three ionization steps three pka values),Henderson-Hasselbalch equation,Relates pH, pKa, and molar concentration of the conjugate acid-base pair pH = pKa +log,6. The amino acid histidine has a side chain for which the pKa is 6.0. Calculate what fraction of the histidine side chains will carry a positive charge at pH 5.4. Be sure to show your work.,Ans: pH = pKa + log A-/HA pKa pH = log HA/A- antilog (pKa pH) = HA/A- antilog (6.0 5.4) = HA/A- 4 = HA/A- or 4A- = HA Therefore, at pH 5.4, 4/5 (80%) of the histidine will be in the protonated form.,Henderson-Hasselbalch equation,Lys-lys,COOH,NH,Lys-lys,COO,Lys-lys,COO,Lys-lys,NH,COO,+3,+2,+1,0,思考题,P195-5,pH = pKa +log,Lys-lys -lys,COOH,Lys-lys -lys,COO,Lys-lys -lys,NH,Lys-lys -lys,NH,COO,COO,保留三分之一+,pH = pKa +log,思考题,一多肽有侧链羧基30个（pk1=4.3），咪唑基15个（pk2=6.0），氨基10个（pk3=10）。两端羧基，氨基的pk分别为COOH=3.5和NH4+=9.5。求该蛋白的PI值 分析： 1）全部质子化后（正）电荷（氨基）：15+10+1=26 2）全部羧基(零电荷)：30+1=30（ 3）30个羧基只需解离26个就可使该肽位于等电点（这时侧链有25个解离，还有5个未解离）,2012年厦门大学生物化学,思考题,pH = pKa +log,25 5,10,氨基酸与相应脂肪酸（胺）解离比较,氨基酸pKa比脂肪酸的-COOH的pKa（一般为45）, 小 氨基酸pKa脂肪胺中的-NH3+的pKa（一般为1011）.小,氨基酸与肽解离比较,-e,+,+,在蛋白质分子中，游离的-NH2和COOH相距较远，静电引力减弱，故： a 末端的NH2的pK值减少 b 末端的COOH的pK值增大,Comparing the pKa Values of Alanine and Polyalanine,Amino acid or peptide pK1-cooH pK2-NH3+ Ala 2.34 9.69 AlaAla 3.12 8.30 AlaAlaAla 3.39 8.03 Ala(Ala)nAla, n大于4 3.42 7.94,The titration of di-, tri-, and larger oligopeptides of alanine also shows the ionization of only two functional groups, although the experimental pKa values aredifferent. The trend in pKa values is summarized in the table.,2011年南京大学生物化学,思考题,Ala-Ala-Ala在PH=7时的结构式，指出Pk1和Pk2代表的解离基团? 说明为什么丙氨酸的链越长Pk1和Pk2的变化越大。（题目给出一张表格分别是一个丙氨酸、两个丙氨酸链、三个丙氨酸链和n个丙氨酸链的Pk1和Pk2，而且Pk1越来越小，Pk2越来越大）,2011年南京大学生物化学,思考题,+,氨基酸解离程度取决于所处溶液的酸碱度。 1、氨基酸的等电点(isoelectric point, pI) ：指氨基酸的正离子浓度和负离子浓度相等时的溶液的pH值称为该氨基酸的等电点,用符号pI表示 (或使氨基酸净电荷为零时溶液的pH值)。,氨基酸的等电点和计算,H+2=K1K2,pH=（pK1+pK2）/2,pI=（pK1+pK2）/2,等电点的计算：中性氨基酸：以Gly为例,等电点相当于该aa两性离子状态两侧解离基团pK值之和的一半。 中性氨基酸 PI = (Pka-羧基 + Pka-氨基)/2 酸性氨基酸 PI = (Pka-羧基 + Pk侧链羧基)/2 碱性氨基酸 PI = (Pka-氨基 + Pk侧链氨基)/2,即：等电点pH值与离子浓度无关，只取决于兼性离子两侧基团的pK值。是否随PH变化？,氨基酸的等电点,酸性氨基酸，以Asp为例：,pK1 -COOH = 2.2 pK2 NH3+ = 9.0 pK3 -R group = 10.5 pI = (pK2+ pK3)/2 = (9+10.5)/2 = 9.75,碱性氨基酸，以Lys为例：,总结,1. 酸性氨基酸的等电点在3左右 2. 中性氨基酸的等电点在6.5左右 3. 碱性氨基酸的等电点在10左右,氨基酸带电荷趋势：PI-PH,1. 在PH值=3时上述三种氨基酸各带什么电荷？ 当PH值分别等于6或7呢？ 2. PH小于（或大于）等电点，等电点越大可能带的正电荷越？等电点越小带的正电荷越？,思考题,问题1：把一个氨基酸结晶加入pH7.0的纯水中，得到pH6.0的溶液，此氨基酸的pI值是大于6.0？小于6.0? 还是等于6.0？ （小于6.0） 问题2： 血液pH= 7.357.45,哪一种氨基酸在血液保持pH稳定方面起重要的缓冲作用？为什么？,pH6.0,氨基酸等电点思考,晶体,PH=7,PH小于7,加酸,H+,H+,PH大于7,H+,加碱,问题1：把一个氨基酸结晶加入pH7.0的纯水中，得到pH6.0的溶液，此氨基酸的pI值是大于6.0？小于6.0? 还是等于6.0？ （小于6.0）,H+,H+,PH,2、氨基酸在等电点的特点：,（b）等电点时缓冲能力最小 （c）蛋白质等电点时溶解度最小。蛋白质等电点沉淀 思考：蛋白质的等电点和等离子点,（a）,氨基酸的甲醛滴定法,在一般情况下，NH3 +在pH12-13时才能出现解离，一般的指示剂则难以指示。加入过量甲醛，滴定过程中降低了氨基的碱性。使滴定曲线向低pH=9转移。,（是非题）用甲醛滴定法测定氨基酸的含量时，甲醛的作用是使氨基酸的-NH3+酸性增强。,南京大学2002年生物化学,甲醛滴定法,应用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（间接滴定） A. 与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。 B. 释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1）,试题：将400ml的丙氨酸溶液调到pH=8.0，然后向该溶液中加入过量的甲醛，所得的溶液用NaOH反滴定到pH=8.0，消耗0.2mol/L的NaOH溶液250ml。问，在起始的溶液中丙氨酸为多少克？（丙氨酸的分子量按89计）（分） 2003年厦门大学生物化学,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,在蛋白质分子中，游离的-NH2和COOH相距较 远，静电引力减弱，故： a 末端的NH2的pK值减少 b 末端的COOH的pK值增大,蛋白质的两性电离,蛋白质的等电点( isoelectric point, pI),当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。,蛋白质的等电点( isoelectric point, pI),pH=pI 时，蛋白质净电荷为零，蛋白质分子在电场 中不移动 pHpI 时，蛋白质净电荷为负，蛋白质分子在电场 中向阳极移动 pHpI 时，蛋白质净电荷为正，蛋白质分子在电场 中向阴极移动 在pI时，蛋白质失去了胶体的稳定条件，即没有相同电荷相互排斥的作用。所以不稳定，溶解度最小，易沉淀。,蛋白质的等电点在有中性盐存在下可以发生明显的变化， 原因是蛋白质分子中某些解离基团与中性盐中的离子相结合。蛋白质的等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。 等离子点（isoionic point）：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点 (蛋白质的等离子点：指在纯水中（即没有其它盐类存在）蛋白质的正离子数等于负离子数的pH值。),蛋白质的等离子点（特征常数）,核酸的酸碱性质,核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。 DNA的pI约为45， RNA的pI约为2.02.5， 在pH78电泳时泳向正极。电泳点样在负极,胞嘧啶核苷酸的解离,1,2,3,六、氨基酸的化学性质,1). -NH2参与的反应 (1).茚三酮的颜色反应 (2).成肽反应 2). -COOH参与的反应 (1). 与亚硝酸反应 (2).与甲醛反应 (3).酰化反应 (4).烷化反应 (5).希夫反应 3). 由-氨基与羧基共同参与的反应 (1).成盐反应 (2).成酯反应 (3).酰卤化反应 (4).脱羧反应 (5).叠氮反应 4). 氨基酸的侧链基团的反应,（一） -羧基参与的反应,成盐、成酯后羧基的化学反应性能被保护，而氨基的化学反应性能得到加强或说氨基被活化，易与酰基或烃基结合。 为什么氨基酸的酰基化和烃基化在碱性溶液中进行？,1、成酯和成盐反应：,Hcl,-羧基参与的反应,用途：这是使氨基酸羧基活化,2、形成酰卤的反应,3、成酰胺反应,氨基酸的氨基与酰氯或酸酐在弱碱溶液中发生作用时，氨基即 被酰基化。例如与苄氧（苯甲氧）甲酰氯反应。,1、与酰化试剂反应,（二）a-氨基参与的反应,酰化试剂作用,用途：是鉴定多肽N-端aa和aa顺序的重要方法。,2. 烃基化反应- Edman试剂反应,Sanger试剂和Sanger,Sanger法。2,4-二硝基氟苯（FNDB)在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定 Sanger，确定了胰岛素的一级结构，1958年获Nobel化学奖。1975年建立了快速测定DNA序列的加、减法，1976年又一次获Nobel Prize.）,P48,DNP ?,简述Sanger氨基酸测序和核苷酸测序的方法？,中国海洋大学2012生物化学试题,3、 形成西佛碱（Schiff）反应,氨基酸的-氨基能与醛类反应生成弱碱，这个弱碱叫西佛碱（Schiffs base).,西佛碱是某些酶促反应的中间产物（如转氨基反应的中间产物）。,思考：有两种重要的具维生素组分的辅酶。它们在酶促反应中都具稳定碳阴离子中间物的作用。请讲出这两种辅酶和对应的维生素的名称，及它们参与催化的主要反应（TPP和PLP）,Effective electron sinks. Pyridoxal phosphate(PLP) stabilizes carbanionic碳负离子 intermediates by serving as an electron sink. Which other prosthetic group catalyzes reactions in this way?（Thiamine pyrophosphate.TPP）,electron sinks,上海交通大学,电子穴（电子陷阱）,电子穴（电子陷阱）,PLP做电子受体,脱氨基 脱羧基,碳负离子,醌型,electron sinks,（三）-氨基和羧基共同参与的反应,茚三酮反应,所有氨基酸及具有游离-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。 应用：氨基酸定性和定量分析（光吸收法和测压法）,茚三酮反应,应用：氨基酸定性和定量分析（光吸收法和测压法）,注意：所有氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸,茚三酮反应的修改,李绍军, 郭蔼光, 梁宗锁,生化教材中关于脯氨酸与茚三酮反应描述的修改建议， 生命的化学， 2005(6):509-510, 脯氨酸是亚氨基酸，没有具- 氨基的氨基酸酸性茚三酮反应。 脯氨酸可以与茚三酮反应，在酸性条件下生成的直接产物是红色的，最大吸收峰值是520 nm。 脯氨酸与酸性茚三酮在有氰化物存在时反应产物是黄色或橙黄色，最大吸收值是440 nm； 脯氨酸与茚三酮在碱性条件下生成不稳定的黄色产物。,2、成肽反应,体内的成肽反应如何 ？,(四) 氨基酸的侧链基团的反应,氨基酸的侧链基团的反应,氨基酸的侧链基团的反应(续),氨基酸的侧链基团的反应,pauly反应,Folin一酚反应,氨基酸的侧链基团的反应,断开二硫键,氧化法,还原法,烷基化试剂保护,巯基乙醇 二硫苏糖醇,过甲酸,五、氨基酸的光学性质和光谱性质,（一）、氨基酸的旋光性和立体化学,氨基酸的构型也是与甘油醛构型比较而确定的,氨基酸的旋光性和立体化学,1、除R=H的甘氨酸外，其他19种基本氨基酸a碳原子均有不对称碳原子，有D-型和L型两种异构体，因而是光学活性物质，构成蛋白质的氨基酸除Gly外均为L-型异构体。 2. Thr和Ile有四种光学异构体。 3、氨基酸的旋光性（符号和大小）取决于它的R基的性质，并与溶液的PH值有关。比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。,氨基酸的旋光性,氨基酸的旋光性（符号和大小）取决于它的R基的性质，并与溶液的PH值有关。比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据。 外消旋物：D-型和L-型的等摩尔混合物。 内消旋物：分子内消旋,物质的构型,1. 手性碳的D型和L型：如单糖、氨基酸和磷脂 2. 双键的顺式与反式：肽键和脂肪酸中的双键 3. 单糖醛基环化后的和型，后者又联系嘧啶 或嘌呤碱糖苷键的型,多是顺式,糖的旋光性和构型,和,嘧啶或嘌呤碱糖苷键的型,糖的D型 和L型,旋光性和构型,1. 肽链中的肽键一般是反式构型， 2. 天然存在的已醛糖都是D型的 3. 天然氨基酸为多L型 4. 戊糖与嘧啶或嘌呤碱以C-N糖苷键连接就称为核苷，型糖苷键,碱基与糖环平面互相垂直，反式存在。,Origin of amino acid homochirality,Tamura K.Molecular handedness of life: significance of RNA aminoacylation.J Biosci. 2009,34(6):991-4.,（二） 氨基酸光谱性质,The UV spectra of the aromatic amino acids at pH 6.,氨基酸的一个重要光学性质是对光有吸收作用，20种蛋白质氨基酸在可见光区域均无光吸收,在远紫外区( 220nm)均有光吸收,在紫外区(近紫外区) (220nm300nm)只有三种氨基酸有光吸收能力,酪氨酸: max275nm， 苯丙氨酸: max257nm， 色氨酸: max280nm，,Spectroscopic Properties of Amino Acids,六、氨基酸的分离分析,(一). 层析法 (chromatography) 分配柱层析 纸层析 薄层层析 离子交换层析法 (二). 电泳法 (Electophy) (三). 气相色谱法 (四). 高效液相层析,(一).层析法(chromatography),色谱法（chromatography）又称“色谱分析”、“色谱分析法”、“层析法”，是一种分离和分析方法，色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质与两相发生相互作用，如吸附、溶解或结合等，结果在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。根据物质的分离机制，又可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。,1、原理：组成层析系统的固定相和流动相具有相反的极性。被分析的样品（如aa混合物）中的各组分依据其自身极性的强弱，与此两相的亲和力不同。与固定相亲和力大者，易留滞于原地，与流动相亲和力大者，易随流动相移动，因而达到分离的目的。,（一）. 分配层析,分配定律：当一种溶质在两种一定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定的温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数。即分配系数（kd）。,分离的先决条件：各种AA成分的分配系数有差异，差异越大，越容易分开。,分 配 层 析,分配层析的原理：逆流分配,固定相,流动相,48,36,27,20.5,分离的先决条件：各种AA成分的分配系数有差异，差异越大，越容易分开。,固定相,流动相,64,64,64,64,64,64,16,64,64,64,64,48,分配系数：3:1,分配层析的原理：逆流分配,2019/8/6,112,可编辑,固定相,流动相,16,64,64,64,64,48,16,64,64,64,64,48,64,4,64,64,64,12,36,12,分配层析的原理：逆流分配,固定相,流动相,4,12,64,64,64,12,4,12,64,64,64,12,64,1,64,64,9,6,18,3,36,36,27,分配层析的原理：逆流分配,分配层析的原理：逆流分配,固定相,流动相,1,6,9,64,64,3,1,6,9,64,64,3,64,0.25,64,6.75,6.75,2.25,6.75,0.75,18,18,20.25,27,27,20.25,分配层析的原理：逆流分配,固定相,流动相,0.25,2.25,6.75,6.75,64,0.75,0.25,2.25,6.75,6.75,64,0.75,64,0.06,5.1,6.8,3.4,0.75,2.25,0.19,6.75,6.75,10.1,20.25,20.25,20.2,20.25,20.25,15.2,分配层析的原理：逆流分配,固定相,流动相,64,64,64,64,64,64,32,64,64,64,64,32,分配系数：1:1,分配层析的原理：逆流分配,固定相,流动相,32,64,64,64,64,32,16,16,64,64,64,16,分配系数：1:1,32,16,分配层析的原理：逆流分配,固定相,流动相,4,12,12,4,64,4,4,12,12,4,64,4,64,2,2,8,12,8,8,2,12,12,12,12,12,8,4,4,2,分配层析的原理：逆流分配,固定相,流动相,64/64,64,64,64,64,64,32/16,64,64,64,64,32/48,A 物质,B 物质,分配层析的原理：逆流分配,固定相,流动相,64/64,12,12,4,64,4,4,12,12,4,64,4,64,2,2,8,12,8,8,2,12,12,12/10.1,12,12,8 /20.2,4,4,2,分配层析的原理：逆流分配,若是逆流分溶或逆流分配，当转移n次后，某一物质在（n+1）个管中分布的分数含量是（p+q)n=1展开式的相应项的值。这里p和q分别为某一物质在静相和动相中的分数含量，即p+q=1。例如物质Y的 Kd=q(动相)/(静相)p=1 即: p+q=1/2+1/2=1 转移n次后,在第k号管中某一物质的含量可由下式计算: n！ pn-k+1 qk-1 Tn,k= （n-k+1）！（k-1）！,2 分配柱层析,3、纸 层 析,原理：纸层析法属于分配层析。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。纤维素吸附的水为固定相，有机溶剂为流动相。当有机溶剂沿滤纸流动时，层析点中的物质就会在有机相和水相中进行分配，其中部分溶质随有机相的不断流动进入水相，或从水相进入有机相，如此进行反复的分配，由于不同物质的分配系数不同、移动速度不同因而得以分离。,相对迁移率Rf,Rf主要与R基的极性有关，溶剂的pH可影响R基的极性，氨基酸与滤纸的吸附作用也影响Rf。在流动相中分配系数越大，移动越快。,预测在以苯酚-甲酚-水为展层剂利用纸层析分离下列氨基酸时Rf值大小顺序： （1） Ala、Leu、Ser （2） Val、Gly、Glu,双向纸层析图,4、薄层层析,4离子交换层析,Separation by Charge,离子交换层析,原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应，由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。离子交换层析，利用氨基酸的两性游离性质，在某一特定PH时，各氨基酸的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。 氨基酸与树脂的亲和力: 取决于它们之间的（1）静电吸引和（2）氨基酸侧链与树脂基质之间的疏水相互作用,离子交换层析,阳离子交换树脂 - 负电荷,+,+,+,阴离子交换树脂 - 正电荷,-,-,-,氨基酸,阳离子交换树脂 - 负电荷,+,+,+,阴离子交换树脂 - 正电荷,-,-,-,氨基酸+,氨基酸,PI=3 PI=7 PI=10,氨基酸-,Ion-exchange chromatography,阳离子交换树脂 - 负电荷,阴离子交换树脂 - 正电荷,-,-,-,1. 氨基酸+,氨基酸,2. 氨基酸+,3. 氨基酸+,Ion-exchange chromatography,Separation by Charge,PI=3 PI=7 PI=10,离子交换层析,阳离子交换树脂 - 负电荷,阴离子交换树脂 - 正电荷,-,-,-,1. 氨基酸+,1. PI=3 2. PI=7 3. PI=10,2. 氨基酸+,3. 氨基酸+,氨基酸（-）,PH？,离子交换树脂,离子交换树脂可以分为阳离子交换树脂（如羧甲基纤维素等）和阴离子交换树脂（如二乙基氨基乙基纤维素等）。,(1) 阳离子交换树脂:供交换的是阳离子,树脂带负电荷,(2)阴离子交换树脂:可供交换的是阴离子，树脂带正电荷,氨基酸的洗脱,Changes in ionic strength or pH,洗脱方法： （1）改变PH值（改变离子电荷） （2）增加离子浓度（竞争作用）.阴离子树脂：降低PH，则阳离子树脂升高PH,氨基酸的洗脱,氨基酸与树脂上解离基团之间的静电引力 氨基酸与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水作用,习题举例,（1）在PI=6时，用阳离子交换柱层析分离Lys、His和Leu的氨基酸的洗脱顺序 （2）在PI=8时，用阴离子交换柱层析分离Glu、Arg和Val的氨基酸的洗脱顺序,阳离子交换树脂洗脱顺序（aa带正电荷）,酸性aa,中性aa,碱性aa,阴离子交换树脂洗脱顺序（aa带负电荷）,先,后,先,后,碱性aa,中性aa,酸性aa,（中国科技大学2002）,习题举例,有一种蛋白质水解物,在pH6时,用阳离子交换柱层析分 离,第一个被洗脱的氨基酸是( ) A. Val (pI5.96) B. Lys (pI9.74) C. Asp(pI2.77) D. Arg(pI10.76) E. Tyr (pI5.66),用强酸型阳离子交换树脂分离下述每对氨基酸，当用pH7.0的缓冲液洗脱时，下述每对中先从柱上洗脱下来的是哪种氨基酸? 天冬氨酸和赖氨酸；精氨酸和甲硫氨酸；谷氨酸和缬氨酸;甘氨酸和亮氨酸；丝氨酸和丙氨酸。,习题举例,解答：用离子交换树脂分离核苷酸主要是根据它们与树脂上相反电荷的静电结合力的 不同以及核苷酸疏水的碱基环与树脂骨架之间非极性吸附力的差异。本来，用阳离子交换树 脂分离这四种核苷酸时，按照它们解离的差异，应该是AMP在CMP之前被洗脱下来。但是，由于嘌岭环比嘧啶环同交换树脂的非极性吸附力大三倍，抵消了它们之间的电荷差异，故出现上面的冼脱顺序。,思考：用阳离子交换树脂分离核苷酸时，核苷酸被洗脱的先后顺序是UMPGMPCMPAMP而不是UMPGMPAMPCMP。为什么?,氨基酸的疏水性质的应用,pH3.5时各核苷酸所带电荷,阴离子交换树脂柱洗脱顺序,（+）,-1 -0.95 -0.46 -0.16,UMP GMP AMP CMP,实际洗脱顺序 CMP AMP UMP GMP,电荷之间作用力相似，嘌呤疏水引力大（难洗脱）,UMP GMP AMP CMP,电荷,小 大 大 小,阴离子交换树脂,疏水作用,（三）、电泳,电泳（electrophoresis）：带电粒子在电场的作用下，向它所带的电荷相反方向泳动的现象称为电泳。氨基酸在pH高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。,电泳 Separation of Amino Acids,分离氨基酸混合物常用纸电泳。,有一种蛋白质水解物,在pH=6时,用电泳分离,怎样控制PH值使氨基酸有效分离？点样应该点在什么位置？ （1）A. Lys (pI9.74) B. Asp(pI2.77) C. Tyr (pI5.66),（2）A. Val (pI5.96) B. Arg(pI10.76) C. Lys (pI9.74),氨基酸电泳分离时电荷一样为什么移动距离不同？,思 考 题,1、 三种氨基酸Thr、Lys和Glu在PH=6进行电泳分离，茚三酮染色，画出分离结果图和正负极. -2011厦门大学生物化学试题,2. 从赖氨酸中分离出谷氨酸的可能性最小的方法是( ) A、纸层析 B、阳离子交换层析 C、阴离子交换层析 D、葡萄糖凝胶过滤 E、电泳 上海交通大学生物化