蛋白质沉淀与等电点.ppt

,实验四,蛋白质的沉淀作用和等电点测定,【实验目的】,1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 3. 了解蛋白质变性与沉淀的关系。 4. 学习蛋白质的两性解离性质。 5. 掌握测定蛋白质等电点的基本方法。,【实验原理】,一、沉淀作用 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为可逆的沉淀反应和不可逆沉淀反应两类。,1.可逆沉淀作用：在发生沉淀作用时，虽然蛋白质已经沉淀析出，然而其分子内部结构并没发生明显的改变，仍保持原有的结构和性质。如除去沉淀因素，蛋白质可重新溶解在原来的溶剂中。因此，这种沉淀作用称为可逆沉淀作用。属于此类的有盐析作用，低温下丙酮、乙醇使蛋白质沉淀的作用，以及利用等电点的沉淀。,（1）盐析作用：用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子的水化膜被剥夺；同时蛋白质分子所带的电荷被中和，因而破坏了蛋白质溶胶的稳定因素，使蛋白质沉淀析出。但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去中性盐或减低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。,（2）有机溶剂沉淀蛋白质：在蛋白质溶液中加入适量丙酮或乙醇，蛋白质分子的水化膜被破坏而沉淀。若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。,2.不可逆沉淀作用 ：一些物理化学因素往往会导致蛋白质分子结构，尤其是空间结构破坏，因而失去其原来的性质，这种蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶剂中。重金属盐，生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超声波和有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉定。,（1）重金属盐类:能与蛋白质分子中的巯基等基团结合，生成不溶物而沉淀。 （2）生物碱试剂:与蛋白质结合形成不溶物而沉淀。植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱（或植物碱）。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。,二、等电点,蛋白质和氨基酸一样都是两性电解质。调节蛋白质溶液的pH值，可使蛋白质分子侧链或末端携带不同的电荷；在某一pH时其分子中的正电荷与负电荷数目相等，即净电荷为零，该pH值称为蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质的溶解度往往较低容易沉淀析出。本实验借助观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。,【实验材料和主要仪器、试剂】,1.实验材料 蛋白质（卵清蛋白）、酪蛋白 2.实验仪器 试管及试管架；刻度吸管；吸耳球、胶头滴管、pH试纸,3.实验试剂,pH4.7 醋酸-醋酸钠的缓冲溶液；3%硝酸银溶液；5%三氯乙酸溶液；95%乙醇；饱和硫酸铵溶液；硫酸铵结晶粉末；0.1mol/L盐酸溶液；0.1mol/L氢氧化钠溶液；0.05mol/L碳酸钠溶液；0.1mol/L醋酸溶液；甲基红溶液；0.4%酪蛋白醋酸钠溶液；醋酸溶液（mol/L）：1.0, 0.1 ,0.01。,【实验步骤】,1、蛋白质的沉淀反应 （1）盐析 加5%卵清蛋白溶液5 ml于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管中内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。 取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。,【实验步骤】,（2）重金属离子沉淀蛋白质：重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。取1支试管，加入蛋白质溶液2 ml，再加3%硝酸银溶液12滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？,【实验步骤】,（3）某些有机酸沉淀蛋白质：取1支试管，加入蛋白质溶液2ml，再加1ml5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。 （4）有机溶剂沉淀蛋白质：取一支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL95%乙醇。观察沉淀的生成。,【实验步骤】,（5）乙醇引起的变性与沉淀 a. 取3支试管编号，依下表顺序加入试剂。,b . 振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水8ml，然后在第2、3号管中各加一滴甲基红，再分别用0.1 mol/L醋酸溶液及0.05mol/L碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1mol/L盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。,【实验步骤】,2、酪蛋白等电点的测定 取同样规格的使馆4支，按照下表顺序分别精确加入各试剂，然后混匀。, 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL，加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH 依次为5.9、5.3、4.7、3.5.观察管溶液的混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH 即为酪蛋白的等电