《核酸生物合成》PPT课件.ppt

第10章 核酸的生物合成,为什么子女与父母非常相象？,生物所以有遗传现象，是与遗传物质DNA的复制有关系的。,中心法则(central dogma) DNA RNA 蛋白质,复制,转录,翻译,逆转录,RNA复制,复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。,几个基本概念：,逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程。,翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的氨基酸顺序的过程。,转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则合成RNA，即将DNA所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程。,第1节 DNA的生物合成,三个方面： 1.复制 2.损伤修复 3.逆转录,一、参与DNA复制的酶及蛋白因子,DNA链合成的条件： dNTP Mg+ 引物 DNA模板 酶和蛋白质因子,三种大肠杆菌DNA聚合酶 1. DNA聚合酶I 3 5外切酶； 5 3聚合酶 5 3外切酶 作用：切除引物、填补空缺、损伤修复,Klenow片段,（一） DNA聚合酶（DNA polymerase）,枯草杆菌蛋白酶,68 kDa,35 kDa,大肠杆菌DNA聚合酶（修复酶）,Large（Klenow）fragment of DNA pol ,2. DNA聚合酶 3 5外切酶 5 3聚合酶 作用：DNA损伤修复 3. DNA聚合酶III 大肠杆菌DNA复制的主要酶,Sliding clamp subunits,聚合酶活性,聚合酶活性,3 5 外切活性, 复合物， 促进亚基二聚体转移 并结合于DNA双螺旋,DNA pol III （复制酶）,促进核心酶 形成二聚体,组装,防止核心酶从模板DNA上滑落,所有DNA聚合酶都只能在模板链的指令下，在引物（通常RNA）3-OH添加新核苷酸功能，没有从头合成活力； 引物酶合成一小段RNA，作为DNA合成的引物； 必须与几种辅助蛋白组装成引发体，才有合成引物的活性。 如：DonaB、DonaC、DonaT、PriA、PriB、PriC等,（二）引物酶和引发体,（三）DNA连接酶（DNA ligase),3,5 磷酸二酯键的形成 哺乳动物：ATP供能， 大肠杆菌：NAD供能， 都需要Mg2+ 在DNA复制、重组及损伤修复中起作用,催化二段DNA链之间3,5 磷酸二酯键的形成,3 OH,5,5,3,O O- P O O-,有缺口的DNA链,DNA连接酶,ATP,AMP+PPi,O O P O O-,5,3,缺口封闭,（四）解螺旋酶,催化DNA双螺旋解链； 需ATP供能。,（五）单链结合蛋白（SSB）,与解开的单链结合，防止形成双螺旋； 防止核酸酶的降解；,（六）拓扑异构酶,拓扑异构酶：解除超螺旋,二、DNA的复制,半保留复制方式,Old strand,New strand,The hypothesis of semiconservative replication proposed by Watson and Crick in 1953.,大肠杆菌培养在15N培养基中,转到14N培养基中，第一代 （50分钟左右）,第二代,DNA复制合成的子代DNA分子中，一条来自亲代DNA分子，另一条是新合成的，所以称为半保留复制。,二、DNA的复制过程,起始、延伸、终止,(2)模板DNA解除高级结构 解螺旋酶把双螺旋解开成单链，SSB立即结合单链。拓扑异构酶解开复制叉前方的超缠现象。 （3）RNA引物的形成 由引发酶以单链DNA为模板，按53合成引物。,1.起始 （1）辨认起始点 DNA复制有固定的起始点（富含AT） 。,DNA双链复制起始点,dnaA,dnaB/dnaC,DNA双链解开成单链DNA,SSB,引物酶,RNA引物/3-OH,DNA聚合酶,dNTP,和3-OH形成35磷酸二酯键,解旋酶,SSB,SSB,3,3,5,5,引发体,解旋酶,拓扑异构酶,原核生物 双向复制 （型复制） 特定起始点：oriC,真核生物 多个复制单位（复制泡） （复制起始点+复制叉） 多个起始点,复制的方向,原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,DNA的起点和方式,基因组能独立进行复制的单位称为复制子。每个复制子都含有控制复制起始的起点（origin），可能还含有终止复制的终点（terminus）。,A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter),真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。,在RNA引物上，由DNA聚合酶催化，在引物3-OH每掺入一个核苷酸，从底物dNTP切下一个焦磷酸。 体内仅存在5 3的DNA聚合酶,2.延伸,在RNA引物上，由DNA聚合酶催化， 体内仅存在5 3的DNA聚合酶,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,随从链,岗崎片段,前导链（leading strand）： DNA复制时，一股以3 5方向的母链作为模板，新合成的链以5 3方向连续合成的链称为前导链。 （复制方向与解链方向一致）,滞后链（lagging strand): DNA复制时，一股以5 3方向的母链作为模板，新合成链沿5 3合成1000-2000个核苷酸不连续的小片段称为滞后链。 （复制方向与解链方向相反),冈崎片段（Okazaki）,岗崎片段由DNA连接酶连成一条完整的新链,DNA半不连续复制： 3 5方向母链为模板，新链5 3方向连续合成5 3方向母链为模板，新链5 3方向合成许多不连续的片段（冈崎片段） 这种复制方式称之为半不连续复制。,去除RNA引物 补充空缺 连接,DNA聚合酶的小片段 5 3外切酶 DNA聚合酶的大片段 3 5外切酶 5 3聚合酶 DNA连接酶,3.终止,当复制叉到分子末端，复制即终止。,严格的碱基配对规律 聚合酶的选择作用 复制时有即时的校读功能 3 5外切酶功能 DNA损伤的修复,三、保证高保真度复制的机制,四、逆转录作用,以RNA为模板合成DNA的过程。 逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）。,逆转录酶性质,催化三种反应： RNA指导的DNA合成 RNA水解 DNA指导的DNA合成,病毒 RNA,RNA DNA(-),DNA(-),DNA(-) DNA(+),1.RNA指导DNA合成,2.RNA水解,3.DNA指导DNA合成,逆转录酶的作用,自发因素 物理因素 化学因素,紫外线损伤 电离辐射损伤（X线/线） 亚硝酸盐 C U 5-溴尿嘧啶 5-BU A 氮芥类 烷化剂 羟胺 C- A,G,G,羟胺,1.造成损伤的原因,五、DNA的损伤、修复与突变,2. DNA损伤修复,光修复 切除修复 重组修复,光复活/光修复 光复活酶识别TT 与之形成复合物 吸收光能 使TT解开成为单体 酶从复合物中释放 仅作用于UV形成的产物,切除修复发生在复制之前,限制性内切酶： 主要降解外源DNA 具有严格的碱基序列专一性 EcoR 第一个字母为大肠杆菌E.coli属名； co为种名的头两个字母； 第四个字母R表示大肠杆菌的菌株； 最后一个罗马数字表示该细菌中已分离出的这一类酶的编号。,3、DNA突变,第2节 RNA的生物合成,基因转录:以DNA为模板的RNA聚合酶的催化下，按照碱基配对原则，以四种NTP为原料，合成一条与DNA互补的RNA链的过程。 不对称转录:DNA双链中一条链的某一区段作为模板合成RNA，而另一条链不用于合成RNA。 转录起始于DNA模板的一个特定位点（启动子），并在一定位点终止（终止子），这个转录区域称为转录单位。,在转录中，双股DNA中只有一条链是模板（模板链）（反意义链） （-链） 另一条链为（编码链）（有意义链） （+链）,一、催化RNA合成的酶,1. 大肠杆菌RNA聚合酶 全酶= 2 核心酶= 2 识别转录起始信号。 参与酶与底物的结合，以及与因子和核心 酶的结合。 参与因子和核心酶的结合，并参与RNA合成的引发、延伸。 与模板的结合、酶的滑动以及碱基识别有关。,大肠杆菌RNA聚合酶的结构示意图,核心酶(2),起始因子, 和模板DNA结合 起始和催化聚合反应 酶的装配、结合启动子等,全酶(2 ),2. 真核细胞RNA聚合酶 在DEAE-Sephadex柱上的洗脱次序称为酶、II、 ，基于对鹅膏蕈碱的敏感程度称为酶A、B、C,二、转录的过程,起始 延伸 终止,1.转录起始,启动子：RNA聚合酶全酶识别、结合、开始转录的DNA 序列（双链）,原核生物启动子的特点: (1)DNA序列在转录起始点的5端区(上游区) (2)-10bp处 -TATAAT- (Pribnow box) (3)-35bp处 -TTGACA- (识别区),原核生物的转录起始,亚基辨认-35区,RNA pol 全酶移向-10区,合成第一个磷酸二酯键,5-GpN-3,转录起始复合物,RNA pol( ) DNApppGpN-OH,亚基脱落,（结合松弛）,（结合紧密）,转录起始不需引物！,16/50,以NTP为原料和能量,DNA模板链为模形成核糖核酸链(RNA),当几个核苷三磷酸掺入后， 亚基就会被释放脱离核心酶。,2.链的延伸,3. 转录终止,终止子（terminator） 提供转录终止信号的DNA序列 终止因子（termination factor） 协助RNA Pol识别终止信号的辅助因子,起始,双链DNA局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,RNA,启动子Promoter,终止子terminator,1.rRNA 的转录后加工 rRNA基因转录原初产物 原核生物：30S 哺乳动物：45S,RNase,三、RNA转录后加工,The 18S, 5.8S, and 28S rRNAs in eukaryotic cells are derived from one pre-rRNA molecule (the processing needs small nucleolar RNA-containing proteins).,2.tRNA的转录后加工,碱基修饰 3端 5端,稀有碱基- T 脱氨 - AMP IMP 还原 - DHU 甲基化- mA mG CCA-OH RNaseP切除多余的核苷酸,真核与原核生物mRNA的区别,原核生物mRNA 多顺反子 转录与翻译同步 mRNA不需加工 寿命短,真核生物mRNA 单顺反子 转录后需加工运至 胞浆再翻译 mRNA需加工 寿命较长,3.mRNA的加工与成熟,加帽 加尾 mRNA前体的剪接,5端：m7GpppGpN 作用:稳定mRNA 5端 和翻译的起始有关 3端: polyA尾巴 作用：稳定mRNA 和翻译模板活性有关 剪除内含子，连接外显子,加工过程主要包括：,DNA复制与转录的比较,相同点,模板 两股链均复制 模板链转录 合成方式 半保留复制 不对称转录 原 料 dNTP NTP 聚合酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 碱基配对 A-T，G-C A-U，T-A，G-C 产物 半保留的双链DNA 单链RNA 引物 需要 不需要,不同点,以DNA为模板 遵循碱基配对原则 都需依赖DNA的聚合酶 聚合过程都是生成磷酸二酯键 新链合成方向为53,3/50,第节 核酸合成的抑制剂,一、核苷酸合成抑制剂,二、与DNA模板结合的抑制剂,三、作用于聚合酶的抑制剂,利福平,本章小结,1. DNA复制的特点。 2. 参与复制的酶。 3. 复制的过程及损伤与修复。 4. RNA转录的特点、过程及产物的加工。,1. 生物遗传信息传递的中心法则中不包括 A. DNA DNA B. DNA RNA C. RNA DNA D. RNA RNA E. 蛋白质 RNA 3关于DNA合成的叙述，正确的是 DNA的生物合成即半保留复制 B. DNA的生物合成必须以DNA为模板 C. DNA的生物合成必须以DNA指导的DNA聚合酶催化 D. DNA的生物合成是半不连续复制 E. DNA的生物合成包括DNA的半保留复制、 DNA修复合成和反转录,7. DNA复制的引物是 A. 以DNA 为模板合成的DNA 片段 B. 以RNA为模板合成的DNA 片段 C. 以DNA 的一个基因为模板合成的RNA 片段 D. 以复制起始处DNA 为模板合成的RNA短片段 E. 引物存在于复制完成的片段中 8.大肠杆菌DNA聚合酶 具有3 5核酸外切酶活性 B. 具有3 5聚合酶活性 C. 不需引物 D. 可催化2个游离的dNTP以3 5 -磷酸二酯键相连 E. 需四种NTP为底物 9.关于DNA复制的需要：解链酶 引物酶 DNA聚合酶拓扑异构酶连接酶作用顺序为 A. 1， 2， 3， 4，5 B. 4，1，2，3，5 C. 1， 4， 3， 2，5 D. 3，4，1，2，5 E. 1， 4， 2， 3，5,10.生物遗传信息传递的中心法则中尚无证据的是 A. RNA 蛋白质 B. DNA RNA C. RNA DNA D. RNA RNA E. 蛋白质 RNA 11.识别转录起始点的是 A. 因子 B. 核心酶 C. RNA聚合酶的因子 D. RNA聚合酶的亚基 E. RNA聚合酶的亚基,4. 真核细胞中DNA的复制是在哪个部位进行的 A. 核蛋白体 B. 线粒体 C. 细胞核 D. 微粒体 E. 细胞浆 5.关于DNA半不连续合成叙述，错误的是 前导链是连续合成的 B. 后随链是不