课件：NSFC申请报告韩苏夏.ppt

国家自然科学基金申请书撰写指导,西安交通大学医学院第一附属医院 韩苏夏,国家自然科学基金的重要性,医院需要 科室需要 团队需要 个人需要,学科标志 研究能力 团队建设 人才培养,申请书撰写前的准备,认真阅读国家自然科学基金条例等相关文件 理思路-善于发现临床中存在的问题，明确自己 思路 找问题-通过临床问题凝练出学科研究的科学问 题、假说、假设,申请书撰写前的准备,看文献寻方向-1年、3年、5年内大杂志、大综述，通过文献寻找科学问题、假说、假设是否成立的依据 选课题-选题最好以问题为导向，不要以技术为导向，需要注重方向性，创新性，实用性和可行性 前期铺垫-预实验结果,2019/8/7,5,标 题,标题是申请书的灵魂、精髓和核心，是摘要的高度概括。标题是你对评审专家说的第一句话, 应体现创新点，新颖，吸引眼球！简洁明确，具体清楚！有新意的关键词可以刻意凸现 ! 撰写模式 一般采用“研究方法（手段）+ 研究对象 + 研究目标”的模式（需要依次表达清楚），不宜过长，字数30 注意事项 创新、创新、再创新 简洁明确、修辞正确、有感召力和可信度 检索类似标题，避免撞车 尽量不要简写,2019/8/7,6,HCV感染及其所致肝癌经基因组免疫途径防治的实验研究 宫颈癌诊断新策略：通过FRET设计的TAT波长转换双分子信标应用的基础研究 重组慢病毒介导TAT-apoptin融蛋白治疗肝癌的实验研究 Apoptin特异性诱导肝脏肿瘤细胞凋亡的机制：MAP4K4及其下游分子扮演角色？ DDR signaling诱导Apoptin促肿瘤放射增敏治疗的研究,标 题,2019/8/7,7,基 本 信 息,申报日期准确、恰当（可向科研管理人员咨询） 申请人信息准确，工作时间每年不少于六个月 资助类别、研究期限和申请经费要恰当 中英文关键词正确、规范,2019/8/7,8,投 送 学 科,仔细分析当年的招标指南。 分析自己申报课题的领域和研究范围。对于正在进行的研究，注意发现有基础性工作与招标指南是可以靠得上的？即便是靠不上，也要注意联系和搭车。对于拟开展的研究，要注意整合各类资源（平时的信息积累）。 分析各个学科口的指南，寻找最恰当的学科投送。 评审人（专家心态：只有很少的份额呀1015%，到底给谁呢？）,2019/8/7,9,摘要是敲门砖,摘要是整个申请书的提纲，是申请人最后写的，却是评审专家最先看的内容，因此是申请书的重中之重，一定要反复修改，精益求精！ 要求：在短短的几百字内要使外行和内行评审人，感觉到摘要内容充满着新意、撰写和阐述的条理性非常清楚。能够引起进一步阅读的兴趣。 达到的目标：通过审阅摘要，了解到你所申请项目目前研究存在的科学问题、现状，想要做什么、怎么做、研究的目的和重要意义。,2019/8/7,10,摘要一般撰写格式,应用基础研究 目前应用存在问题是 研究目的 选用材料，使用技术，采用 方法，实现目标 为奠定基础提供思路,2019/8/7,11,既往使用表达自杀基因的复制缺欠病毒治疗恶性肿瘤的研究中，发现复制缺欠病毒不能将治疗基因全部转导至体内所有的肿瘤细胞，而启动自杀基因只能杀死导入治疗基因的肿瘤，残存瘤细胞会快速的增殖，导致治疗的失败。本课题目的是探寻更有效、安全和特异治疗恶性肿瘤的生物学方法。我们选用鸡贫血病毒特异诱导肿瘤细胞凋亡(不损害正常细胞)的VP3(apoptin)为目的基因，使用重组慢病毒技术来增强目的基因在肝癌内的转导能力；使用信号肽和引导肽序列来实现非肿瘤细胞转导后的长期持续分泌表达；采用Ant-apoptin和TAT-apoptin融合表达方式保证治疗分子可以进入未转导重组病毒的残余瘤细胞和已经转移的瘤细胞,并确保治疗分子导入瘤细胞核内的靶部位 。这样，在确保安全性的同时也增强其治疗作用，为肝癌的基因治疗创立新方法和更有效的手段，使肿瘤的基因治疗有新突破。,2019/8/7,12,基础研究 用方法（手段）进行研究， 探索/证明问题， 对阐明机制揭示规律有重要意义， 为奠定基础提供思路 如是连续项目，请简述前期结果，提出新问题,摘要一般撰写格式,2019/8/7,13,本课题组前期研究结果证实：Apoptin这一来源于鸡贫血病毒的小蛋白，能够特异性诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无凋亡诱导作用。MAP4K4是一种丝苏氨酸蛋白激酶，与Apoptin存在特异性结合位点。我们前期实验发现MAP4K4在肝脏肿瘤中的表达高于肝正常组织，结合相关文献作出大胆推测：MAP4K4使Apoptin磷酸化，磷酸化后的Apoptin发生多聚化并与某些蛋白质结合，形成蛋白质复合体移位至细胞核，进入细胞核的复合体与核内的DNA结合影响DNA的有效转录合成，诱导肿瘤细胞凋亡。本课题拟通过调节MAP4K4表达水平，观察其对Apoptin特异性诱导肝肿瘤细胞凋亡的影响及相关蛋白的改变，研究MAP4K4及其下游分子在Apoptin特异性诱导肝肿瘤细胞凋亡的作用。通过以上研究阐明Apoptin诱导肝脏肿瘤细胞凋亡的分子机制，为探寻新的肿瘤标志物，且开展以此为靶标的肿瘤诊疗奠定理论基础。,2019/8/7,14,立项依据（字数控制在2500字以内）,研究意义 撰写模式 研究领域主要问题热点研究方向 热点研究方向尚未解决的具体科学问题提出假设阐述解决该问题（研究目标）的科学贡献（理论意义或应用前景） 注意事项 逻辑性强，条理清楚；提出的问题准确，设想在理论上可行 写成国内外研究现状，没有提炼出研究的意义 完全没有阐述课题的基本研究内容 阐述研究的必要性、意义和价值 对科学意义的阐述不足或夸大,2019/8/7,15,原发性肝癌(primary hepatocelluar carcinoma)是一种常见的恶性肿瘤,适于手术切除的病例很少，且术后复发率高达60-80%，而放疗和化疗的缓解率又很低。我国是肝癌的高发区，每年约有10万人死于肝癌，占我国恶性肿瘤死亡的第二位1。因此肝癌的治疗研究是急需解决的重要课题，新的治疗药物研究迫在眉睫,而基于肿瘤起源、发展的复杂性，探寻一种有效的、安全的、特异的、提高缓解率的治疗药物更是当务之急。十年前已经开始研究使用病毒载体转导杀伤基因来治疗肝癌,此技术对体外培养的肿瘤细胞显示了理想的杀伤作用,人们对此寄以很高的期望，但使用于临床病人和在体的肝癌动物时,其疗效是不令人满意的，原因是其基因转导效率和表达水平偏低。,因此，虽然逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、单纯疱疹病毒等各种病毒载体相继被研究者使用, 但距期望的效果甚远。究其原因,认为与重组病毒的非复制性有关。因为任何一种非复制性重组病毒,无论通过哪种使用方法，均不可能感染实体瘤组织内或已经转移的所有肿瘤细胞，自杀基因只能使转导了病毒的肿瘤细胞死亡，随着已转导病毒的肿瘤细胞死亡,治疗基因的表达也就趋于终止，未转导病毒的肿瘤细胞会快速生长使肿瘤复发。病毒的非复制性是确保其安全性的保证,虽然近来也有研究者使用条件性复制病毒和对人类少有致病性的复制性微小病毒治疗实体瘤的研究报告,但其安全性仍不能确保，人类将面临实验室产生的、能毁灭人类的新病毒。因此，在确保安全性的条件下,需探寻一种使用非复制重组病毒有效杀伤实 体瘤的新理论和新方法。,立 项 依 据,国内外研究现状及发展动态分析 包括研究现状，存在问题，解决思路！ 撰写要点 从研究领域切入，引出当前的热点研究方向 从研究方向展开，阐明在该方向上存在的问题 围绕存在的问题，提出该方面的空白点、未知数和难点 展示我们解决问题的理论依据或实验依据 适时适量地提示我们的前期工作 必要时对拟采用的技术方法进行介绍和分析 准确提炼出本项目的研究设想,近年来，体外增殖鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)的研究结果表明：CAV仅在转化的鸡细胞系复制，而且依赖转化细胞的特定细胞组分来完成自己的复制，这一生物学特征也在人源细胞系的实验中得到证实。分子病毒学研究表明：CAV 的VP3蛋白（又称Apoptin）和VP2蛋白协同作用,改变细胞线粒体的膜电位使线粒体释放细胞色素C和凋亡诱导因子，导致宿主细胞的快速凋亡2,3。体外合成或基因工程表达的CAV Apoptin特异的引起多种人源性恶性肿瘤细胞的凋亡3,4,但对正常二倍体体细胞无作用5,6。这种对细胞的选择性凋亡方式，说明Apoptin在未来肿瘤治疗中具有迷人的巨大应用前景7, 这种特异性杀伤肿瘤细胞和恶性转化细胞,不伤害正常细胞的蛋白质和相关肽的发现为使用重组病毒治疗肿瘤带来了转机。,进一步的研究表明，Apoptin的肿瘤细胞特异性与其在细胞中的亚细胞定位有关，在转化或肿瘤细胞中，Apoptin定位于细胞核，而在正常细胞中定位于细胞质。Apoptin的磷酸化决定其核定位，在肿瘤细胞中，Apoptin被磷酸化，磷酸化的Apoptin进入细胞核，并诱导细胞凋亡。而且Apoptin的表达水平是诱导凋亡有效性的重要取决条件8。因此，我们使用重组慢病毒技术来表达这类蛋白质和肽物质,以提高Apoptin的基因转导效率并使其能够持续高表达。当重组病毒注射到实体瘤之后,它既能感染肿瘤细胞又能感染实体瘤中的非肿瘤细胞,在感染了重组病毒的肿瘤细胞死亡之后,非肿瘤细胞不会因为表达这些蛋白出现任何伤害,它在一个较长的时间内可以持续表达杀伤肿瘤细胞的分子。 同时一些研究揭示，有效的诱导肿瘤细胞凋亡既需要Apopotin的高表达也需要其核定位9,10。虽然在Apoptin的分子结构中存在核定位信号11, 12,13,但在人和动物的实体瘤内,如肝癌,实现以上条件还有很大技术困难14,15 。,若我们能通过分泌表达原理,在表达分子的氨基或氨基端融合一种具有蛋白质转导结构域(PTD)的肽,非肿瘤细胞内的表达分子就会自由进入残存的肿瘤细胞或转移的肿瘤细胞起到持续性追杀肿瘤的目的，这样蛋白质转导结构域(PTD)就增加了Ant-Apoptin或TAT-Apoptin向细胞和细胞核内的转导。上述思想在确保重组病毒安全性的条件下,提高并持续性增强了杀伤肿瘤的蛋白质和肽的表达，在理论上具有诱人的前景，为治疗实体瘤找到了安全,特异和有效的生物治疗方法。重组慢病毒载体是近年来使用的转导效率高的病毒载体,在改造HIV的病毒的复制元件并提高了安全性后,使用泡沫口炎病毒衣壳蛋白作为重组病毒的衣壳,大大提高了转导效率,同时感染分裂和非分裂细胞。蛋白质转导结构域(PTD)是近年来发现的一种非受体依赖和非能量依赖的新转导理论和方法16,17。研究最多的是果蝇Antennapedia homeodomain protein(Ant)和HIV的TAT, 它们能够携带核酸,蛋白和肽自由的通过细胞膜和核膜18,19。根据这个理论，我们已经成功的表达了,P53的羧基肽-Ant融合肽，其诱导了肿瘤细胞的坏死和凋亡。本课题设计使用改造病毒载体的目的不但是为了提高转导效率, 而且在表达盒中设计了可分泌表达的信号肽-引导肽元件。采用Ant和TAT-Apoptin融合表达技术20,21,22,目的是促进Apoptin进入肿瘤细胞核并促使已表达的Apoptin无阻碍的进入毗邻的甚至已经转移的肿瘤细胞23,24。当重组病毒感染肿瘤细胞后除了能杀死该细胞之外,它分泌的目的蛋白可以杀死毗邻的肿瘤细胞;更重要的是当肿瘤内的非肿瘤细胞,如间质细胞、免疫活性细胞和血管上皮细胞转导了重组病毒后，表达的Ant-Apoptin和TAT-Apoptin不损害这些非肿瘤细胞,它们可以长期存活并持久表达可分泌的目的蛋白,对实体瘤内的残存肿瘤细胞和已经转移的肿瘤细胞,起到长期持续的杀伤作用。这在以前的肿瘤基因治疗研究中是无法完成的。我们期望该课题的研究能够为肿瘤的基因治疗进入临床开辟新道路。,本课题的研究是探寻有效的、安全的和特异的治疗恶性肿瘤的生物学方法。我们选用了鸡贫血病毒的VP3,Apoptin蛋白作为治疗肿瘤的特异分子,使用重组慢病毒技术来增强目的基因在实体瘤内的转导能力,使用信号肽和引导肽序列来实现非肿瘤细胞转导后的长期持续分泌表达.采用Ant-Apoptin和TAT-Apoptin融合表达方式, 保证治疗分子可以进入未转导重组病毒的残余肿瘤细胞和已经转移的肿瘤细胞,并确保治疗分子导入肿瘤细胞核内的靶部位。通过以上设计来实现对肝癌等实体瘤安全有效的特异性治疗。,立 项 依 据,国内外研究现状及发展动态分析 注意事项 层层展开、强调分析综合；着重找出别人研究的不足或缺陷 综述不全面，忽略了重要进展，提出的问题别人已解决 围绕课题的思路进行综述，层次清晰，观点鲜明 逻辑思路不清晰，没有围绕一个中心问题进行综述 研究现状和分析准确客观 论述既要充分又要简练 简单移植或夸大，可行性差,文献类别要全：以国外文献为主，也要引用国内同行知名专家的文献；引文信息要全；文献年代要新：主要是近五年的文献，最好能有申报当年的最新文献。 撰写模式 作者姓名、题目、具体出处(包括期刊名、年份、卷期、页码等)，2030条；新，精，准！ 注意事项 正文中重要的论点均要有文献标注 引文信息，格式规范统一，与正文相对应 尽可能引用最新的英文文献（近三年占到2/3左右）和顶级期刊文献 常见问题：过于陈旧；参考文献不够全面；格式不统一,立 项 依 据,研 究 目 标,研究目标撰写要点 指研究要达到的目的（最终结果），是对标题进一步的具体化，是研究对象、研究方法、成果和应用的高度概括。 不能够转写成为研究内容中阶段性成果的罗列。 通常使用一、两句话表达清楚。,一般撰写格式 明确关系，揭示规律，阐明原理（机制），建立方法等。探寻一种治疗肝癌等实体瘤安全的、有效的、特异的生物学方法, 为实体瘤的基因治疗带来新突破,研 究 目 标,2019/8/7,27,可编辑,研 究 内 容,研究内容是指围绕研究目标拟开展的实验研究。内容要适当：确保研究周期内完成；为目标服务：与研究目标相辅相成；要重点阐述：注意与技术路线区别 。 撰写要求 围绕研究目标逐次展开 研究内容层次分明 研究方法恰当，可操作性强，具有可行性 注意事项内容要适当，确保研究周期内完成 内容要适当，确保研究周期内完成 内容过多，研究周期难以完成 为目标服务，阐述重点 内容分散，不能集中阐明研究目标；与研究方案混淆，罗列实验步骤 问题准确，方法科学、先进,克隆CAV VP3的基因克隆：从患病鸡的外周血淋巴细胞内分离DNA, 使用PCR方法建立CAV VP3/apoptin克隆,测序证实(已完成)。 构建具有信号肽-引导肽-TAT(Ant)-apoptin表达盒：在已经构建的NT4信号肽-引导肽-ADNF重组载体中使用酶切获取NT4信号肽-引导肽-cDNA片段,合成TAT(Ant)渗透肽cDNA片段,通过Hind III同apoptin基因连接构建TAT(Ant)-appotin融合基因片段,通过常规分子生物方法构建NT4信号肽-引导肽- TAT(Ant)-apoptin表达盒。 构建表达TAT(Ant)-apoptin的重组慢病毒：使用常规分子生物学方法将NT4信号肽-引导肽- TAT(Ant)-apoptin表达盒插入到慢病毒重组载体pLenti6/V5-D-TOPO载体中,同pLp/VSVG和pLP1和pLP2四质粒共转染293细胞, Blasticidin筛查阳性转化克隆,增殖后收获表达目的基因的重组病毒。,构建表达TAT(Ant)-EGFP报告基因的重组慢病毒：使用常规分子生物学方法将NT4信号肽-引导肽- TAT(Ant)-EGFP表达盒插入到慢病毒重组载体pLenti6/V5-D-TOPO载体中,同pLp/VSVG和pLP1和pLP2四质粒共转染293细胞, Blasticidin筛查阳性转化克隆,增殖后收获表达报告基因的重组病毒。 表达TAT(Ant)-apoptin的重组慢病毒对肝癌细胞的体外治疗作用：培养P53缺失,P53变异和具有野生性P53的肝癌细胞,感染表达TAT(Ant)-apoptin的重组慢病毒和 表达TAT(Ant)-EGFP报告基因的重组慢病毒,观察转导效率和使肿瘤凋亡能力。,表达TAT(Ant)-apoptin的重组慢病毒对裸鼠移植瘤和转移肿瘤的治疗作用：接种肝癌细胞到裸鼠皮下,制备移植瘤和移植后转移瘤动物模型,肿瘤注射表达TAT(Ant)-apoptin的重组慢病毒,通过病理学检测观察对肿瘤治疗作用和对转移病灶的治疗作用。 表达TAT(Ant)-apoptin的重组慢病毒诱导肿瘤凋亡的特异性和安全性：分离人包皮成纤维细胞和脐静脉血管内皮细胞,体外培养和转导表达TAT(Ant)-apoptin的重组慢病毒,观察目的基因的表达和对非肿瘤细胞的影响.将表达TAT(Ant)-apoptin的重组慢病毒和表达TAT(Ant)-EGFP报告基因的重组慢病毒注射到小鼠肝脏,病理学检查目的基因的表达和对正常肝细胞的影响。,拟解决的关键科学问题,什么是关键科学问题？ 关键科学问题-是指研究过程中对达到预期目标有重要影响的某些研究内容或因素，以及为达预期目标所必须掌握的关键技术或研究手段，包括课题设计中具体的关键科学问题和技术问题。提炼个，为什么？意义何在？ 撰写模式 自己研究的领域的关键科学问题本研究逻辑思路意义已具备的科学发现、硬件和软件条件最关键问题的解决方案 注意事项：找准关键问题，并提出解决办法；特别注意必要时提供实验失败候选方案不会总结，未能抓住关键问题或抓得不准；过于简单；和其他部分重复,研 究 方 案,研究方案是指课题实施中具体的、可执行的工作方案和流程，应对该部分予以强有力的支持和说明，使评审专家感到实验设计得合理、可行，能够获得良好实验结果。 撰写要求： 以研究项目的需求为前提，尽量采用最适 合的方 法和手段，并将其操作步骤和关键环节体现在技术路线当中。 常见问题 过于简单：在方案中只有方法名称而无具体步骤。 过于繁杂：大量罗列一些常规的实验方法。,研 究 方 法,研究方法撰写要点 研究方法（拟采取的研究方案及可行性分析）。 主要指在研究的过程中，所应用到（采用）的方法学问题包括：有关实验方法、手段、技术路线和方案、关键技术等，均应给予强有力的支持和说明，使评审人感到实验设计的合理、可行、能够获得良好的实验结果。 此段描述不好的缺陷是让人感觉到实验不可行或者根本完不成课题的实验。同时注意实验设计的范围，太大使人感到不易完成，太小使人感到份量不够。,技 术 路 线,技术路线撰写要点 实际上是完成课题的实验流程图。 针对研究目标、研究内容、研究方法等所制定的合理、可行的路径，这个路径使评阅人能够清楚的看明白。 描述时一定要与前面的研究目的、研究内容、研究目标等内容有密切的关联，这几个环节密切相关相互衔接。 达到研究目标明确、研究内容充实、研究范围合理、实验设计较为完善、技术路线可行。,可 行 性 分 析,可行性分析-考察课题组是否有能力和条件完成所申请的课题。从思路、技术、条件和人员角度，使用中性词，给出具体理由, 能够说服评审专家！ 撰写模式 对实验方案设计的理论分析 研究手段方法分析 预实验结果分析 对相关条件的分析 注意事项 理论可行性、条件可行性、研究基础可行性 不知道从何处开始分析； 不知道哪些问题可以体现课题设计的可行性 容易让人怀疑的研究内容和方案需要特别说明,举例： 理论上具有可行性： 有前期实验结果支持： 良好的研究工作基础： 专业互补的课题组成员： 技术成熟： 实验设备有保障：,可 行 性 分 析,特 色 与 创 新,特色与创新即在本项目研究领域中申请者与国内外同行所不同。应从对包括项目的立论依据、研究内容、研究方法与手段、技术路线及其实验方案上的研究与创新点进行概括、提炼并集中反映出来。 学术思想（理论）的创新 资源创新 技术或者方法学的创新 创新点可以体现近期的研究成果，更要突出深入和延续研究的必要性。,本项目的特色与创新之处的撰写要点 假设创新通过实验、临床过程，提出研究的假设，期望通过手段和方法证明假设？ 思路创新与既往研究不同的设计思路，期望通过方法和手段证明是思路创新？ 技术或者方法创新采用何种实验方法，实验技术解决项目中关键问题。 资源创新疾病家系、血清库、标本库、数据库等。,特 色 与 创 新,一般写作格式 本研究的特色是从方面入手，对的问题进行研究，期望阐明，揭示机制。这些研究在国内外鲜有报告。此外，通过的研究，为临床的应用提供实验基础。,特 色 与 创 新,年 度 计 划,年度研究计划撰写要点 注意要客观、合理的划分年度计划进展，以体现所制定的目标能够完成。 注意论文撰写篇数和质量，包括：SCI、 MI、EI、国内统计源或者核心期刊、国内外学术会议等。,年度研究计划撰写要点 人才培养（研究团队、博士、硕士研究生培养），一般面上项目，培养12名博士或者2 3名硕士，不要太多。 一般预留出6个月的时间进行总结。 此段撰写的目标基本上是按照课题的研究内容、研究方法和技术路线所制定的方案进行。 切记研究内容、范围、工作量的控制，撰写的太大、太多不易完成。,年 度 计 划,预 期 研 究 成 果,预期研究成果撰写要点 理论成果在某一理论方面有所建树、创新。 应用成果在某项关键技术、方法学上获得创新。 预期研究成果与“研究特色和创新”基本上应该一致。 预期研究结果也还包括：拟组织的国内、外重要学术交流活动、国际合作项目、交流计划、发表学术论文等。,预期结果要考虑对基础和实用双重的价值，如果能够建立一套实物体系是最佳的结果。 一般发表论文和申请专利结题比较容易。好标志是SCI 收录的杂志。 最终结题情况是基金委专家们最关心的事情。,预 期 研 究 成 果,举例： 理论成果：建立/丰富/补充/填补 技术方法：建立/完善 专利成果：可望获得 论文专著：SCI论文（具体数）、学术著作（具 体数） 人才培养：青年科技骨干、博硕研究生,预 期 研 究 成 果,研 究 基 础,工作基础包括申报者个人、团队或学校相关工作基础、人员和设备资源。学术积累，方法和技术建立(特别是关键技术),预实验结果！ 撰写模式 项目的理论基础、前期工作发现的问题、预实验研究结果 所在单位的研究工作的积累；技