利用分子标记辅助选择技术选育具有中等直链淀粉含量的早稻品种.pdf

第 2 3卷 第 2期 2 0 0 4年4月 华中农业大学学报 J o u r n a l o f Hu a z h o n g Ag r i c u l t u r a l Un i v e r s i t y Vo 1 2 3 No 2 Ap r 2 0 0 4。 1 8 3 1 8 6 利用分子标记辅助选择技术选育 具有 中等直链淀粉含量的早稻品种 * 夏明元 李进波 张建华 万丙 良 戚华雄一 ( 湖北省农业科 学院作物育种栽培研 究所， 武汉 4 3 0 0 6 4 ) 摘要利用高产早稻品系 4 3 8 4和优质早稻品种舟 9 0 3杂交， 杂交后代与 4 3 8 4回交后连续 自交， 在分离世 代利用 Wx基因的酶切扩增多态性序列( C AP S ) 标记选择 Wx基因型中具有 1 v r 位点的单株或株系， 并在田间 选择农艺性状。在 B C F 6 获得 9 2个 Wx基因型纯合的株系， 从中选择 7 个农艺性状较优以及外观品质较好的 株系进入小区观察试验。综合农艺性状的表现和米质分析的结果， 初步选育出产量较高及直链淀粉含量适中的 品系 z 0 8 O和 Z 1 1 5 。 关键词水稻； 直链淀粉含量；酶切扩增多态性序列； 分子标记辅助选择 中图法分类号S 5 1 1 3 1 0 3 5 3 我国稻米品质的要素主要包括碾磨 品质 、 外 观 品质和蒸煮食味品质等 3 个方面的 1 4项指标 ， 即出 糙率、 整精米率 、 垩 白粒率 、 垩白度 、 直链淀粉含量 、 胶稠度 、 粒型 、 食味品质等。蒸 煮食味品质是稻米品 质最主要 的决定因素 ， 其 中又 以直链淀粉含量最 为 重要。稻米的直链淀粉与支链淀粉组成了精米组分 的 9 O 左右， 其组成 比例对稻米 的吸水性、 胀性 、 粘 性 、 软硬度等蒸煮食味品质有着决定性 的影响， 直链 淀粉含量 即是反映这一组成 比例的指标。 由Wx基因编码 的颗粒结合淀粉合成酶即 Wx 蛋白控制直链淀粉含量的合成， 以玉米的 Wx基因作 探针已经分离到水稻的 Wx基因 。Ay r e s 等 。 发现 在 Wx基因的 5 端引导区存在一个多态性单核苷酸 位点 ， 中低 直 链淀 粉 含量 的品种 ( 1 8 ) 都 具有 A 兀 序列； 而高直链淀粉含量 的品种则含有 A G G T A T A 。由于不同的Wx基因无法用传统的方 法加以区分 ， 同时该基因的表达还受剂量效应和其它 环境因素的影响， 因此在育种实践中很难根据表型确 定 Wx基因型。因此， 在水稻育种中利用分子标记辅 助选择技术在育种早期世代对直链淀粉含量进行检 测可以极大地提高品质育种的选择效率。 近年来， 国内外在水稻品质性状 的分子标记方 面做 了大量的研究 ， 但多数工作都只是基因定位或 品种遗传差异等方面的基础研究 ， 而真正将分子标 记辅助选择技术应用于水稻品质改 良的例子尚不多 见。本研究利用 Wx基因的 C AP S ( C l e a v e d a mp l i fl e d p o l y mo r p h i c s e q u e n c e ， 酶切扩增 多态性序列 ) 标记开展水稻直链淀粉含量 的分子标 记辅助育种， 将优质性状导人高产 品种 ， 从而选育优质高产水稻 品种 。 1 材料与方法 1 1 亲本材料 以高直链淀粉含量 的高产品系 4 3 8 4为轮 回亲 本， 中等直链淀粉含量的优质 品种舟 9 0 3为基 因供 体， 回交 1 代后 自交。 1 2 田间选择和分子标记辅助选择 在 1 2 0 株 B C F 代群体中利用分子标记选择 了 5 6个杂合单株 ； 其后在田问种植 5 6个株系， 从中 选择农艺性 状较 好 的 2 0个株 系利 用 Wx基 因的 C AP S标记检测 Wx基因型。经过 3 a 7代的选育 ， 最后获得了 9 2个 Wx基因型纯合 的株系 ， 从中选择 一 部分进行小区观察试验和品质分析。 应 用 于 检 测 w 基 因 的 引 物 序 列 为 4 8 4 收稿 日期 ： 2 0 0 3 一 l 1 2 8 *湖北省“ 十五” 重点攻关项 日、 湖北省农业科学 院 自立项 目资助 *通讯作者 夏明元 ， 男 ， 1 9 6 6年生， 助理研究员I ： 作单位 ： 湖北 省农科 院住物育种找培研究所， 武汉 1 3 0 0 6 l 维普资讯 华 中 农 业 大 学 学 报 第 2 3卷 w2 引， 其 序 列 分 别 为 5 一 C 1 v r TGT C TAT C T CAAGAC AC一 3 和 5 一 TTTCCAGCCCAAC AC CT TAC - 3 。P C R反应采用 P E的 9 6 0 0型热循环仪 ， 在 0 2 mL离心管中进行 。扩增反应物 的总体积为 2 0 L， 其 中 包 括 1 P C R 缓 冲 液， Mg 。 1 5 mmo l L， d NTP s 0 2 mmo l I ， 上下游引物各为 5 0 p mo l ， 水稻基 因组 DNA 1 5 n g L， Ta q酶 1个单 位 ( Ta Ka Ra产 品) 。反应 程序 为 ： 9 5预 变性 4 mi n后 ； 按 9 4 4 5 S ， 5 5 3 0 S ， 7 2 1 mi n的 l顷 序扩增 3 5 个循环 ； 最后在 7 2延伸 5 mi n结束反 应。P C R结束后， 在 2 0 I 扩增产物中加入 2 2 4 L 1 0 酶解缓 冲液 和 2个单 位 的 Ac c I内切 酶 ( Ta Ka R a产品) ， 在 3 7。 C恒温箱中保温 1 h 。酶切 产物在 1 的琼脂 糖 凝胶 中电泳 ( 1TAE缓 冲 液) ， 溴化乙锭染色后于紫外灯下观察 、 照相。 1 3品质分析 参照优质稻谷 GB T1 7 8 9 1 1 9 9 9各项指标的品 质分析方法 ， 由农业部食 品质量监督检验测试 中心 5 0 0 b p 、 2 5 0 b p 、 1 0 0 b p - ( 武汉) 分析测试样品的整精米率 、 直链淀粉含量 、 胶 稠度 。 2 结果与分析 2 1 Wx 基 因的分子标记辅助选择 应用 w|丁基 因 的 CA PS标 记 检 测 4 3 8 4和 舟 9 0 3 ， 亲本之间具有 多态性 。舟 9 0 3的 P C R产物不 含有 Ac c I的酶切位 点， 扩增长 度约 为 2 4 0 b p ； 而 4 3 8 4的 P C R产物含有 A c c I的酶切位点 ， 根据 Wx 基因的部分 D NA序列 图分析l_ 】 ， 酶切 后形成长 度 基本相近的 2个 片段 ( 约为 1 1 0 b p和 1 3 0 b p ) ， 在 1 9 6 的琼脂糖凝胶中这 2个片断重叠形成 1条泳带 ( 图 1 ) 。 在 B C F 代 选 择 Wx 基 因 型 的杂 合 体 自交 ( 图 1 ) ； 自交分离世代在 田间选择农艺性状和外观 品质的基础上 ， 结合 分子标 记检 测个 体或 株系 的 肌基因型 ( 图 2 ) 。逐代选择和检测后 ， 7个农艺性 状较优、 外观品质较好 的株系进入小 区观察试验。 图 1 B e , F 的 Wx基因凝胶 电泳图 F i g 1 Ele c t r o p h o r e s i s o f W x g e n e i n B Cl F 1 CR p r o d u c t d i g e s t e d byAc c I1：4 3 8 4； 2：Zh o u 9 0 3； 3 1 2：p l a n t i n t K； 1 F1 P CR p r o du c t un di g e s t e d， 1 3 ：4 3 8 4； 1 4：Z h o u 9 0 3 图 2 B O I F ! 的 Wx基因凝胶 电泳图( P C R产物经 c j酶切 ) F i g 2 Ele c t r o p h o r e s i s o f Wx g e n e i n BC： PCR p r o d u c t d i g e s t e d b y Ac c I 1 ：j 3 8l ； !：Zh o u 9 0 3 ； 3 。 I 3 p l a n t i n BC F ： 2 2 育成品系的的农艺性状以及产量结果 考种结果来看 所选品系的株 叶形态和农艺性状与 在田间对农艺性状选择 ， 获得 7个株叶形态较4 3 8 1 相比 仍有较大差别。 好的优 良品 系。2 0 0 3年 在 武 汉 种 植 小 区 ( 6 6 7 2 3 育成品系的米质分析 I T I 。 ) 考察农艺性状和产量 ， 结果见表 1 。 对 1 8个 品 系 或 品 种 的 米 质 分 析 结 果 表 明 所有入选品系的实际产量高于优质基因的供体 ( 表 2 ) ， 具 有 r T基 因型的品系直链淀 粉含量均较 品种舟 9 0 3 ， 但低于受体品系 4 3 8 , 1 。从田间表现和低 变幅从 9 3 7 到 1 8 9 1 ， 大部分品系的直链淀 维普资讯 第 2 期 夏明元等： 利用分子标记辅助选择技术选育具有中等直链淀粉含量的早稻品种 1 8 5 粉含量低于基 因供体 品种舟 9 0 3 ； 具有 G G 基因型 的品系 直链 淀 粉含 量 均较 高， 变 幅从 2 3 1 8 到 2 6 9 3 ， 与基 因供体 品种 4 3 8 4的直链淀粉含量基 本接近； 而具有 GT基 因型的品系直链淀粉含量则 在 2 0 O 0 左 右， 接近 2个 亲本材料 的平 均值。从 表 2 可 以看出， Z l 1 5和 Z l 1 6为具有不 同 W 基 因 型姊妹系 ， 其直链淀粉含量与其具有相应基 因型 的 亲本材料相 当。 表 1 部分品系的农 艺性 状和产量结果” Ta b l e 1 Ag r o n o mi c t r a i t s a n d y i e l d in s e l e c t e d l i n e s 1 ) P H： P l a n t h e i g h t ；P P ：P r o d u c t i v e p a n i c l e ；F G：F i l l e d g r a i n s p a n i c l e ；S P：S p i k e 1 e t s P a n i c 1 e ；S S ：S e e d s e t t i n g r a t e ； GW ：1 0 0 0 一 g r a i n we i g h t ；Y：Yi e l d 表 2 水稻品系的基因型检 测与部分品质性状的分析” Ta b l e 2 An a l y s i s o f q u a l i t y a n d wa x y g e n o t y p e i n 1 8 r i c e l i n e s 1 ) HR ：H e a d r i c e ；AC：Amy l o s e c o n t e n t ； ：Ge l c o n s i s t e n c y 上述结果表明， Wx基 因的 5 端引导区内的多及直链淀粉含量适 中的 2个品系即 Z 0 8 0和 Z1 1 5进 态性单核苷酸位点确实是影响水稻直链淀粉含量的行进一步试验。 主要因素， 这一位点的变化将 直接 引起水稻直链淀 论 粉含量的升高或下降。 综合产量考察和品质分析结果 初选产量较高 有关水稻直链淀粉含量 的基 因定位已经有很多 维普资讯 1 8 6 华 中 农 业 大 学 学 报 第 2 3卷 报道 ， 直链淀粉含量主要受主效基因( 即 Wx基 因) 和微效基因控制 ， 但对微效基因的研究结果并不 一 致 。在本文的研究 结果 中 ， 具有不同基因型的品 系在直链淀粉含量上有 明显的区别 ， 说 明可以利用 Wx基因的 C AP S标记在育种早期世代对直链淀粉 含量 进 行 检 测。同 时 我 们 在 B C F 代 ( 来 自于 B C F 代的杂合体 自交) 对 Wx基 因的遗传分离情 况进行 了研究 ， 在 3 3 3个 被 检测 的个 体 中 G G ： GT： 1 v r基因型分别为 1 0 2：1 5 1： 8 0 ， 经 测验 ， 符合 1： 2： 1的分离 比例 。本研究 中不 同品系特别 是具有 1 v r基因型的品系之间直链淀粉含量的变幅 很大 ， 真正具有 中等直链 淀粉含量 的 品系 ( 1 8 左 右) 并不多， 实际上也说明了直链淀粉含量的遗传除 了受 Wx基因控制之外 ， 还受多个微效基因的影响。 蔡秀玲等_ 6 的研究结果也证实 了这点。 4 3 8 4是湖北省农科院作物所 2 0 0 0年育成的高 产早稻品系， 在 2 0 0 1年湖北省区试中， 比对照品种嘉 育 9 4 8增产达极显著水平 ， 但直链淀粉含量偏高， 米 质较差 ； 而舟 9 0 3 是“ 九五” 期间南方稻区重点推广的 优质早稻 品种， 直链淀粉含量 1 6 左右。本研究期 望利用分子标记辅助选择技术将舟 9 0 3 的中等直链 淀粉含量基因型导人高产品系 4 3 8 4 ， 但最终仅获得少 数品质较优的品系， 主要原因在于回交世代不够以及 在南繁加代或秋繁过程中田间选择不够准确。 本研究对水稻直链 淀粉含量的遗传改 良具有一 定的指导意义。尽管分子标记辅助选择具有在全生 育期直接对控制直链淀粉含量的基因型进行选择等 优点 ， 但由于该性状 由主效基 因和微效基 因共 同控 制 ， 因此仅仅对主效基 因进行分子标记辅助选择还 不能完全实现对 目 标性状的定向选择。解决这一问 题的途径就是设计合理的分子育种方案将分子标记 辅助选择技术和回交育种等 常规技术结合起 来， 从 而实现 目标性状 的定 向改 良。 参考文献 1 W a n g Z Y，Wu Z I ，Xi n g Y Y，e t a 1 Nu c l e o t i d e s e q ue n c e o f r i c e wa x y g e n e Nu c l Ac i d s Re s ，1 9 9 0，1 8 ： 5 8 9 8 2 Ay r e s N M，Mc Cl u n g A M ，La r k i n P D，e t a 1 Mi c r o s a t e l l i t e s a nd a s i n gl e - n uc l e o t i d e p o l y mo r ph i s m d i ffe r e n t i a t e a p p a r e nt a my l o s e c l a s s e s i n a n e xt e n d e d p e d i g r e e o f US ric e g e r m p l a s mTh e o r App l Ge n e t ，1 9 9 7，9 4： 7 7 3 7 81 3 T a n Y F，X i n g Y Z ，I i J X，e t a 1 G e n e t i c b a s e s o f a p p e a r a n ce q u a l i t y o f r i c e g r a i ns i n Sh a ny ou 63 ，a n e l i t e r i c e h y b rid Th e o r Ap p l Ge n e t ，2 0 0 0 ，1 0 1 ： 8 2 3 8 2 9 4 He P，L i SG，Qi a nQ，e t a 1 Ge n e t i c a n a l y s i s o f r i c e g r a i n q ua l i t y Th e or Ap p l Ge n e t ， 1 9 9 9，98 ： 5 02 5 08 5 黄祖六 ， 谭学林 ， Tr a g o o n r u n g S等稻米 直链淀粉含量基因座位 的分子标记定位作物学 报， 2 0 0 0 ，2 6 t 7 7 7 7 8 2 6 蔡秀玲 ， 刘 巧泉 ， 汤述 翥等用于筛选直链淀粉 含量为 中等 的籼 稻品种的分子标记植物生 理与分子 生物学学报 ， 2 0 0 2 ， 2 8 ( 2 ) ： 1 3 7 】 4 4 Br e e d i ng o f Ea r l y I n d i c a Ri c e wi t h I nt e r me d i a t e Amy l o s e Co n t e n t b y M o l e c u l a r M a r k e r - a i d e d S e l e c t i o n Xi a Mi n g y u a n Li J i n b o Z h a n g J i a n h u a W a n Bi n g l i a n g Qi Hu a x i o n g ( I n s t i t u t e o f C r o p B r e e d i n g a n d C u l t i v a t i o n，Hu b e i Ac a d e my o f Agr i c u l t u r a l S c i e n c e s ，W u h a n 4 3 0 0 6 4， C h i n a ) Ab s t r a c t I n o r d e r t o g e t r i c e l i n e wi t h h i g h y i e l d a n d g o o d q u a l i t y，a n e a r l y i n d i c a r i c e v a r i e t y Zh o u 9 0 3 wi t h g o o d q u a l i t y wa s b a c k g r o s s wi t h 4 3 8 4 ，a r i c e l i n e wi t h h i g h y i e l d Bo t h p h e n o t y p i c s e l e c t i o n a n d CAPS( Cl e a v e d a mp l i f i e d p o l y mo r p h i c s e q u e n c e )ma r k