实验二SDSPAGE凝胶电泳.ppt

SDS-PAGE凝胶电泳,实 验 二,SDS-PAGE凝胶电泳,实验原理 实验步骤 注意事项 SDS-PAGE的优点 SDS-PAGE的缺点 实验常见问题及处理 小技巧,实验原理,源起 基本原理 分类 分离范围,源起,1967年由Shapiro建立。 1969年由Weber和Osborn进一步完善。 他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷因素可以忽视.,丙烯酰胺,N,N-亚甲基双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,四甲基乙二胺(TEMED),过硫酸胺(AP),激活作用,激活作用,共聚合,基本原理之一,阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子之间及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 强还原剂巯基乙醇打开蛋白质分子内的二硫键使这种结合更加充分。,基本原理之二,结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长椭圆棒，不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短轴长度恒定，而长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比。 这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下，其迁移率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的影响，而主要取决于其分子量大小这一因素。根据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小分开。,分类,PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类. 连续系统电泳体系中,缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。,电泳槽,不连续系统,不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。,浓缩胶,浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。,分离胶,孔径较小,通过选择合适的凝胶浓度,可以使样品很好的分离.,凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离胶。在上下电泳槽内充以Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连续性。在浓缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左右，在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl-蛋白质H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而H2NCH2COO- 称为慢离子。,浓缩效应之一,浓缩效应之二,电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。,样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解离为负离子，泳动速率加快，很快超过蛋白质，高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一的外加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同，使得各种蛋白质的泳动速率不同而形成一条条区带。,电荷效应之一,电荷效应之二,与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化，在水溶液中SDS-蛋白质复合物都具有相似的形状，使得SDS-PAGE电泳的泳动率不再受蛋白质原有电荷与形状的影响。因此，各种SDS-蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。,电荷效应之三,在SDS-PAGE电泳中，由于SDS这种阴离子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别；此外，由多亚基组成的蛋白质和SDS结合后都解离成亚单位，这是因为SDS破坏了蛋白质氢键、疏水键等非共价键。,SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS-蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。,分离范围,凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用515%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：,双丙烯酰胺丙烯酰胺摩尔比为 1：29。,上样缓冲液之一,上样缓冲液(SDS-PAGE loading buffer)是一种以溴酚蓝为染料，5倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液，用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。 本产品分为还原型和非还原型两种，还原型上样缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链间二硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离，在电泳凝胶上显现多个蛋白条带，选购和使用时请务必注明，仔细区分。,上样缓冲液 之二,注意事项 还原型上样缓冲液中含一定量的DTT（二硫苏糖醇）或巯基乙醇，有轻微刺激性气味，较易区分； 含巯基的试剂有一定的毒性，为了安全和健康，应穿实验服并戴一次性手套操作。,上样缓冲液 之三,使用说明 1.按每4 l蛋白样品加入1l蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5X)。 2. 100或沸水浴加热35min，以充分变性蛋白。 3. 冷却到室温后取上清直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 4. 通常电泳时染料到达胶的底端附近（0.5 1cm)即可停止电泳。,增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。 上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。 指示剂检测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿 。,上样缓冲液 之四,甲醇/冰醋酸固定液,甲醇/冰醋酸固定液,甲醇：有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差(亲和力小且易自溶)。甲醇固定的特点是杀死快，渗透力强，对组织收缩较大(可收缩20左右)，可使材料变硬。 冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又称为冰醋酸。常用0.30.5的浓度作为固定液。冰醋酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、氯仿混合。,染色剂,考马斯亮蓝染色 常用染色方法 银染法 金属离子染色法 以考马斯亮蓝染色为例,考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。,考马斯亮蓝,考马斯亮蓝,考马斯亮蓝最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01000gmL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。,实验步骤,试剂配制 (1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中。 4，12月 （2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.9)： 称取Tris 18.2g, 加入50ml水,用1mol/L盐酸调pH8.8,最后用蒸馏水定容至100ml。,（4）1.0mol/LTris-HCl缓冲液(pH6.8): 称取Tris12.1g,加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8,最后用蒸馏水定容至100ml （5）0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)：称取Tris0.6g,加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0,最后用蒸馏水定容至100ml （）TEMED（四甲基乙二胺）,（）样品溶解液： SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml （）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀 （）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用,（1）脱色液： 冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml （1）电极缓冲液 （内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml,（12）高分子量标准蛋白试剂盒: 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 置-20保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。 （13）样品：兔血清,. 聚胶前准备,(1) 配制10过硫酸铵溶液(需每天新鲜配制)。 (2) 将单体储存液、缓冲液、水按照一定比例配制成凝胶溶液。 (3) 将灌胶装置准备好。 (4) 待凝胶溶液平衡至室温(2325)后，真空脱气15 min。,1）.安装膜具 将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 将凡士林均匀的涂在两侧的封条上，用封条将玻璃板封好。 称取2g琼脂糖加100ml蒸馏水，慢慢的煮开（煮的过程中要不断搅拌），将煮好的(无气泡)琼脂糖倒入支胶架三分之二高度，快速将两侧封好的玻璃板插入琼脂糖中，注意凹槽朝外，用夹子固定好，待凝固后灌胶。,2）制备SDS聚丙烯酰胺凝胶 制备分离胶 30%丙烯酰胺5ml + 分离胶缓冲液 5ml +10%SDS 0.2ml +10%过硫酸铵 0.2ml + 蒸馏水 9.6 ml；混匀后加入8ul TEMED,立即混匀（不能有气泡），灌入安装好的垂直板中，灌胶时要匀速贴壁流入，防止气泡产生。灌至离槽沿3cm处，立即在胶面上用移液管加入1-2cm的蒸馏水，静置，待凝胶聚合后（约30min），去除水相，然后用吸水纸吸干残余的水。,制备浓缩胶 30%丙烯酰胺 1.32ml + 浓缩胶缓冲液 1ml +10%SDS 0.08ml +10% AP 0.08ml + 蒸馏水 5.6 ml；混匀后加入8ul TEMED,立即混匀（不能有气泡），灌入垂直板至离槽沿0.5cm处，插入梳子（不能混入气泡），静置，待凝胶聚合后，加入电泳缓冲液，拔去梳子。,先用刀片将琼脂糖剥离开，再将玻璃板从架子上取出，再用夹子固定在电泳槽内（注意凹槽朝内），将电泳缓冲液倒入电泳槽内。 3).样品预处理 取0.5ml样品加入0.5ml上样缓冲液，置沸水中煮5分钟。 4).上样 第一个孔内加20ul标准蛋白质溶液 其他每孔加入20ul样品。上样时要将移液枪头垂直插入孔内且要缓慢匀速推入样品。,垂直板电泳装置,加样,样品迁移方向,5).电泳 接通电源，将电压调至80V、50mA。当溴酚兰进入分离胶后，把电压提高到150V、80mA，电泳至溴酚兰距离胶底部1-2cm处，停止电泳。 6).固定 取下凝胶，置于培养皿中的固定液中，轻轻振摇10分钟，倒去固定液。 7).染色脱色 培养皿中倒入50-60度预热的染色液浸没凝胶，约40分钟后回收染色液，用清水冲洗掉胶上多余的染色液。倒入脱色液，脱色2小时，期间换脱色液2-3次。,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,夹在两块玻璃板之间的凝胶,电泳缓冲液,电泳缓冲液,加在槽中的经SDS处理的样品,分子量小,分子量大,电源,电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后的凝胶照片,图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱,94 000 62 000 43 000 31 000 20 100 14 400,注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白,.结果处理,标准蛋白分子量,未知蛋白,在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。,相对迁移率,实验注意事项,1.形成凝胶的试剂要有足够的纯度：丙烯酰胺是形成凝胶溶液中的最主要成份，其纯度的好坏将直接影响凝胶的质量，丙烯酰胺可能混有的影响凝胶形成的杂质有：线性多聚丙烯酰胺、金属离子等。 2. 注意不能随便倾倒单体溶液，应加入过量的催化剂使其完全聚合成无毒性的聚丙烯酰胺后再弃置。,3. TEMED中混有氧化试剂后其自身极易被氧化而失去催化能力，另外TEMED的氧化产物呈黄色，以此可以鉴定TEMED的质量。如果无法获得无色透明的TEMED，只能适当增加用量以保证聚胶速度。,4. 过硫酸铵容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的过硫酸铵会渐渐失去活性。保存固体过硫酸铵应密闭干燥。过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。另外在配制凝胶溶液时过硫酸铵不易过量，否则会使蛋白质在电泳过程中被氧化(主要指天然无变性剂凝胶)。,5. 激活剂的用量: 激活剂的浓度适当与否不仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量。增加过硫酸铵或TEMED的用量，将使丙烯酰胺聚合链长度缩短，凝胶会变得脆弱而失去应有的柔性。二者多至一定程度时，聚合链长度过短，将不会形成肉眼可见的凝胶，这些短链多聚物呈溶液状，只是其粘度较聚合前高一些。,6. 温度的影响聚胶的最佳温度为2325 ，需要注意灌胶前单体溶液(通常置于4冰箱)及玻璃板或管(有时从烘箱取出)也要平衡至此温度。由于溶液在抽真空时仍维持较低温度，需待其升至室温后再脱气，另外升温后脱去氧气的速度较低温时快。,7. 氧气的影响氧气会与被激活的单体自由基作用抑制聚合过程，因此需在加激活剂前对单体溶液脱气。如果省去这一步骤，凝胶仍能聚合但需更多的激活剂，并且不能保证很好的重复性，充分去除氧气可以用尽量少的激活剂得到最佳聚合效果。通常在较好的真空度脱气至少15 min 。,8. 凝胶添加剂：凝胶中常常加入SDS、尿素、Triton X-100等添加剂。SDS加入后不会对凝胶的聚合产生影响，但尿素会使凝胶孔径变小，这一特性可用来分离小分子蛋白质或多肽。,9. 聚胶时间：虽然应用过硫酸铵TEMED催化后灌胶1520 min即可观察到凝胶的形成，但至少需90 min才能保证95以上的单链聚合成长短以及具有合适的孔径大小。采用核黄素时聚胶时间需更长，但它一般用于等电聚焦即根据蛋白质的电荷性质进行分离，对孔径大小要求不高，因此不必等很长时间(完全聚合需8 h)。,10. 单体的浓度：是指单体总重量(丙烯酰胺+bis)在溶液中的百分比(wv)，可选择的范围为330，单体浓度增加后聚合速度将加快，因此可适当减少催化剂的用量。 11. SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4g SDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。,12. 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且SDS-PAGE测定分子量有10误差，不可完全信任。 13. 有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。,14. 有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。 15. 如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。,常见问题及处理办法,纹理和拖尾现象 由于样品溶解不佳引起的，克服的方法可以在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素。 蛋白带过宽，与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量。,电泳时间比正常要长 可能由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的pH选择错误。 指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形）：说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率。,.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向下的曲线形），由于电泳槽的装置不合适，尤其是凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全 .凝胶时间不对 通常胶在30min内凝聚如果凝聚得太慢，可能是TEMED，APS剂不够或者失效,7.出现“皱眉”（两边向下中间鼓起） 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。,8.出现“鬼带” 如何处理？ “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。,9.为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。,SDS-PAGE的优点,设备简单 快速 分辨率和灵敏度高 特别适用于寡聚蛋白及其亚基的分析鉴定和分子量的测定,SDS-PAGE的缺点,1. 有