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液相色谱基础知识,戴安中国HPLC销售培训 2005年,关于色谱,色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析仪器 常见的分离方式： 蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤 等等,色谱 是其中一种分离工具,色谱法简介,色谱法（Chromatography）溯源 俄国科学加1903年发现色谱的吸附原理，开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸于俄文的文献 1906年正式命名（见诸文献） 色谱法；Chromatography 30年代开始广泛研究和应用 主要是气相色谱及薄层色谱 高效液相色谱法的广泛应用始于70年代,色谱的发明人,俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献,色谱分离的机理,分离是一个物理的过程,流动相（Mobile Phase） 固定相（Stationary Phase） 样品（溶解于流动相中的溶质）,什么是液相色谱,气相色谱：流动相是气相 液相色谱：流动相是液相,什么是高效液相色谱,High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC 是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段： 高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器 广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段,HPLC的仪器配置及流程,溶剂,色谱泵,自动进样器,HPLC色谱柱,检测器,废液,数据处理系统,HPLC的仪器配置及流程,色谱泵,自动进样器,色谱柱及柱温箱,检测器,数据处理系统,溶剂,色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram）,色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。, 色谱峰,保留时间（分）,基线 ,峰高,峰宽,响应值,液相色谱图相关术语,色谱峰 Peak 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线 峰底 Peak Base 峰的起点与终点之间连接的直线 峰高 Peak Height 峰最大值到峰底的距离 峰宽 Peak Width 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 半（高）峰宽 Peak Width at Half Height 通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离,液相色谱图相关术语,峰面积 Peak Area 峰与峰底之间的面积,又称响应值 标准偏差； Standard Error 0.607倍峰高处所对应峰宽的一半 拖尾峰 Tailing Peak 后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰 Leading Peak 前沿较后沿平缓的不对称峰 鬼峰 Ghost Peak 并非由试样所产生的峰；亦称假峰,液相色谱图相关术语,基线 Baseline 在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线 基线飘移 Baseline Drift 基线随时间定向的缓慢变化 基线噪声；N Baseline Noise 由各种因素所引起的基线波动 谱带扩展 Band Broadening 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象,液相色谱图相关术语,死时间，t0 Dead time 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间 保留时间，tR Retention time 组分从进样到出现峰最大值所需的时间 死体积，V0 Dead volume 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积 保留体积，VR Retention volume 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积,液相色谱应用：制备型液相色谱,分离及纯化样品是液相色谱原理的直接利用 对分离及纯化的要求 化合物的稳定性 样品的复杂性 制备量的要求 纯度的要求，及纯度的鉴定 方法的安全性,色谱方法转换,如果没有与文献或要求相近的色谱柱 转换进样量 转换流速,液相色谱应用：分析型液相色谱,定量分析主要基于与标准品的比较 是其最大应用领域 定性分析；不是色谱的强项 基于样品的保留时间比较 借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器 对定量及定性分析的要求 灵敏度、精度及准确度的要求 样品量的要求；复杂样品的分析能力 容易使用,液相色谱原理 基本概念及方法开发,液相色谱实验所需的基本参数 流动相：种类及配比，等度或梯度 固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量 以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色谱条件,评价液相色谱方法的标准,问题：什么样的分离结果是好的？分离度？,什么是色谱的分离度,分离度的公式：,R：分离程度的量度,影响分离度的因素：K、及N,分离度方程： K 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱 是分离因子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素 N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度,若 N 增加 2倍 或 3倍 , R会如何变化?,分离度方程解析：柱效项,N 理论塔板数：分离效率的量度,PW = .5,PW = 2,色谱柱的柱效 N,理论塔板数计算公式： W s 方法 Wtan 16 切线法 Wh 5.54 半峰高 W3s 9 3s W4s 16 4s W5s 25 5s,峰宽与塔板数的关系,理论塔板数,峰宽（L）,k 2，Vo 1000L,塔板数与流速的关系,流速（cm/min）,塔板数 103,分离度与 N 的关系,分离度方程解析：分离因子项,若 = 1.1 or 1.4，R 会如何变化？, 分离因子：峰分离程度的量度,分离因子：,定义： a =1 时两组分分不开， 改变a的途径 改变固定相或改变流动相 改变温度 改变样品的本身性质,通过改变流动相改变，同样强度的不同溶剂 改变色谱柱,改变分离因子 的例子,若 = 1, 2, 10 or 20, R会如何变化?,分离度方程解析：容量因子项,K 容量因子：保留能力的量度,V0,V1,V2,V3,时间 0.5 1 2 5,k 值 k项 k对分离度影响 0 0 0 1 1/2 .50 2 2/3 .67 3 3/4 .75 10 10/11 .91 20 20/21 .95,容量因子 k 与分离度的关系,与 R 的关系,容量因子 k 与峰高的关系,改变 k 值的方法： 调节流动相的极性、pH、离子强度等 梯度淋洗,改变容量因子 K 的例子,谱图,、k 及 N 如何控制分离度,液相色谱原理 更进一步的探讨,离子型化合物的分离方式 多数化合物是离子型的！ 使用离子交换柱：离子交换法 主要用于“强”阴、阳离子 使用反相柱 离子抑制色谱法：通过改变流动相的pH值，使样品成中性 离子对色谱法：加入“对离子”，使样品呈中性,离子抑制色谱,离子型化合物在反相色谱柱上不保留 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离 主要适用于弱酸性化合物的分离 降低流动相的pH值，使样品降低离子化 使用硅胶基质C18填料 使用条件应在填料基质的范围内 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内,离子抑制色谱实例,而在乙腈/水并且pH=7时，多数组份保留时间很短，无法完全分离。,离子抑制色谱的使用范围,下列情况下不能使用离子抑制方法，如果： 一些酸在pH低于2时还保持离子化 一些碱在pH高于7时还保持离子化 可以有以下的选择 离子交换色谱 使用聚合物或其他耐碱性流动相的反相柱，在pH高于7时用离子抑制法 使用“离子对色谱法”,在高pH值下用离子抑制,色谱柱：D18-613(聚合物基质)，室温 流动相：乙腈/0.01M NH4OH + 0.01M TBA 流 速：1.0ml/min 检 测：UV-240nm 样 品：巴比妥的衍生物 巴比妥 己琐巴比妥 甲基苯巴比妥 速可巴比妥,离子对色谱法,在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂 与样品中可电离的组份形成“对离子” 在反相色谱柱上分离离子型化合物 离子对试剂的类型： 磷酸季丁铵（PIC A），适用于弱酸 烷基磺酸盐（PIC B），适用于弱碱 烷基长度不同，形成对离子的能力不同 通常有：B5，B6，B7，B8 后面的数字是碳链的长度 磷酸二丁胺（PIC D4），适用于弱碱,离子对色谱机理,使用五烷基磺酸盐,Packing: Bondapak C18 Column: 4 mm ID x 30cm Solvent: Methanol/H2O with 0.005M PENTANE Sulfonic Acid & 1% HOAc (50/50) Flow Rate: 2.0 ml/min Detector: UV, 254 nm, 0.1 AUFS,1. Maleic Acid 2. Phenylephrine - HCl 3. Phenylpropanolamine - HCl 4. Naphazoline - HCl 5. Phenacetin 6. Pyrilamine Maleate,使用六烷基磺酸盐,Packing: Bondapak C18 Column: 4 mm ID x 30cm Solvent: Methanol/Water with 0.005M HEXANE Sulfonic Acid & 1% HOAc (50/50) Flow Rate: 2.0 ml/min Detector: UV, 254 nm, 0.1 AUFS,1. Maleic Acid 2. Phenylephrine - HCl 3. Phenylpropanolamine - HCl 4. Naphazoline - HCl 5. Phenacetin 6. Pyrilamine Maleate,用离子对、还是用离子抑制方法？,开发液相色谱方法的考虑因素,分离度是色谱分离中主要考虑的因素 除分离度之外，在开发色谱方法时，以下几个因素也都要考虑： 灵敏度 载样量 分析速度 溶剂损耗,成本 容易使用 色谱柱寿命 效率,基本的HPLC系统,色谱泵及液相色谱对泵的要求,稳定平滑并且重现性好的流速 可靠且充分的溶剂混合 准确及重现的自动溶剂混合 准确及重现的梯度形成 有效的流速范围 制备色谱或微柱、窄柱色谱更为关注 滞后体积 仅仅应用于梯度实验 目的：在任何情况下保持最高精度,梯度：高压混合,高压梯度 使用多台色谱泵，在泵后混合 配置灵活、简单，脱气简单 易调节梯度的滞后体积,梯度：低压混合,低压梯度 用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合 对脱气要求高 不易调节梯度的滞后体积 如设计不当，梯度的 准确性受影响 滞后体积（系统 体积）设计合理,梯度滞后：系统体积的影响,注意滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路,梯度滞后大小的影响,滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min 实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题 对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受 滞后体积的不同会使方法转换麻烦 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好 普通分析型液相色谱的滞后体积为24ml,滞后体积变化的影响,设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果： 梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性,色谱柱反压变化对梯度实验的影响,P680A LPG without pulse damper Back-pressure: 60 bar, 85 bar and 105 bar Variation: 1%,Pump with pulse damper Back-pressure: 60 bar, 85 bar and 105 bar Variation: 2%,Acclaim 120, C18, 5 m, 4.6 x 100 mm; 0.5 mL/min; 25C; 5 L injection volume; UV detection at 256 nm; Eluent (A) Water and (B) Acetonitril; Gradient: 30 % b to 100 % B in 10 min; Methyl-, Ethyl-, Propyl- and Butylparabene, 10 mg/L each,液相色谱的检测器,常规检测器 示差折光检测器（Refractive Index） 紫外/可见光吸收检测器（UV-Vis） 荧光检测器（Fluorescence） 蒸发光散射检测器（Evaporative Light Scattering） 其他检测器（Other Detectors） 高端检测器 光电二极管矩阵检测器（Photodiode Array） 质谱检测器（Mass Spectrometry）,HPLC检测器应提供的功能,对样品有响应并有一个输出信号 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并且所设计的校正技术应该促进这种关系