质粒提取及琼脂糖凝胶电泳.ppt

实验六 质粒提取及琼脂糖凝胶电泳,山东大学医学院生物化学与分子生物学研究所,DNA重组：指不同来源的DNA片段共价连接，通过重新组合，构成了具有两个DNA分子遗传信息的新的重组体DNA。 DNA体外重组技术：是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法感兴趣的目的基因，在体外与载体DNA分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并筛选出表达重组DNA的活细胞，加以纯化、扩增、成为克隆，这一过程称为DNA体外重组技术。DNA体外重组技术是基因工程的核心内容。,基因克隆简介,目的基因 载体 酶切，连接 重组基因 转入 受体细胞 筛选阳性克隆,分,切、接,转,筛,分子生物学实验流程图,第一次,第二次,第三次,载体：可容忍外源性DNA片段插入，可在细胞间转移并能在细胞内自主复制的DNA分子。 理想的质粒克隆载体应具有的特性： 能在宿主细胞中独立复制，并能携带DNA片段一同扩增 具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点,即多克隆位点(MCS, multiple cloning sites)， 便于进行克隆,分子量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制 易于导入受体细胞具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性、 -互补显色反应（蓝白斑筛选） 表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导序列，增强子等调控元件 生物安全性好,载体种类： 质粒 噬菌体载体 酵母人工染色体（YAC） 病毒载体,常用的克隆载体,质粒 1.定义：质粒是独立存在于细菌染色体外的，能独立复制的环状双链DNA分子。可赋予宿主细胞一定生物学性状，如：抗生素抗性Ampr等。,2来源 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 3分类 质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和严紧型质粒 严紧型质粒(Stringent control) 严紧型质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有 1 个或几个质粒,如 F 因子。 松弛型质粒(Relaxed control) 松弛型质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在 20 个以上,如 Col质粒。 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。,4.质粒的构型 （1）. 超螺旋DNA （supercoiled DNA, sc DNA）,超螺旋,（2）.开环DNA (open circle DNA, oc DNA),开环DNA,（3）.线形DNA（linear circle DNA，lc DNA),与本实验有关的两种质粒,1.PBR322(作为目的基因供体),4363bp,2.PUC18(作为载体）,实验 质粒DNA提取,实验目的 1.掌握碱裂解法提取质粒的原理和方法。 2.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作技术。,碱裂解法提取质粒原理 碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的分子大小和结构不同利用二者之间变性和复性的差异来实现分离的。,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳分离DNA原理,带电颗粒在电场中泳动的速度,由于电场力的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动；此颗粒在泳动过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f)阻挡；当这两种力相等时，颗粒则以均匀速度()向前泳动,式中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的黏度，即 式中 f阻力，牛顿； r粒子半径，米； 介质粘度，牛顿秒/米2；,从公式看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，而与颗粒半径和介质黏度成反比,电泳迁移率 电泳迁移率（mobility）:在电位强度E的影响下，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。,d 为带电颗粒泳动的距离(cm)； l 为支持物的有效长度(cm)； t为通电时间(秒)； V为加在支持物两端的实际电压(V),单位是cm2sec-1 V-1,实验步骤,加1.5ml培养物于EP管，12000rpm30S 重复一次，最后一次 将EP管放在吸水纸上扣干 除去上清，加入冰的100 l 溶液I，剧烈振荡EP管 以下动作要轻柔 加入200l 溶液II，温和颠倒数次，室温放置3min 加入150l 冰溶液III，温和颠倒2-3次，冰浴5min，12000rpm10min 转移上清到新EP管（统一吸400 l ） 加入等体积氯仿，温和混匀，12000rpm2min 上层水相转移到新EP管（统一吸300 l ） 加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀，室温静置5min，12000rpm5min 弃上清，沉淀中加1ml 70%乙醇，12000rpm2min 去上清，管平放室温静置20-30min， 40 l TE 溶解DNA,琼脂糖凝胶板的制备 （封板、制备1%凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳）,倒缓冲液，加样 （取质粒DNA样品液 10l + 2l上样缓冲液，轻轻混匀，避免气泡 ）,电泳（100V 0.5小时，5V/cm） 检测 （紫外灯下检测）,主要试剂及作用,1.solution： 蔗糖：增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒. (保护作用) EDTA ：络合掉镁等二价金属离子, 防止DNA酶对质粒分子的降解作用。（保护作用） TrisHCl ：能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）,2.solutionII： SDS的作用裂解细胞和蛋白质变性作用 NaOH（PH12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用） 0.2mol/L NaOH 1%SDS 临用前新鲜配制.,3.solutionIII： HAC溶液能中和溶液的碱性，使质粒DNA复性。 KAC会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。,4. 氯仿：进一步沉淀去除蛋白质 5. 无水乙醇：沉淀质粒DNA 6. 70%乙醇：洗涤质粒DNA 7. 上样缓冲液（6x）：, 50%蔗糖：增加密度，以确保DNA样品沉入点样孔内。 溴酚蓝：指示前沿。,便于观察DNA片段的位置,质粒三种构型电泳时泳动速度大小？ 超螺旋DNA线形DNA开环DNA,在一定电场强度下