牛初乳中乳铁蛋白的分离纯化及其抗菌活性研究.pdf

江西畜牧兽 医杂志 2 0 1 1 年第 1 期 文章编号： 1 0 0 4 2 3 4 ( 2 0 1 1 ) 0 1 0 0 0 8 0 3 中图分类号： s 8 一 O 5 文献标识码 ： A 实 验 研 究 牛初乳 中乳铁蛋 白的分 离纯化及 其抗 菌活性研 究 邬向东 ， 李平华 ， 陈如圣 ， 全炳昭 ， 罗军荣 ( 1 江西农业大学动科 院， 江西南昌 3 3 0 0 4 5 ； 2 江西农业大学兽 医院) 摘要 ： 本试验 以饱和f N H 4 ) 2 S 0 4 析法从 江西南昌市某牛场母 牛初乳 中分 离到乳铁( 1 a c t o f e r r i n ， L V ) ， Y = S e p h a d e x G 一 1 0 0 葡聚糖凝胶过柱纯化， 并利用聚乙二醇( P E G 6 0 0 0 ) 获得 了牛初乳乳铁蛋白。同时用猪常见细菌病病原猪大肠杆菌fE c o l i ) 、 猪传染性接触性胸膜肺炎放线菌( A P P ) 以液体培养方法进行 了抑菌试验， 结果表明， 分离纯化的L F 对E e o l i , A P P 有 明显的抑制作用， 其抑茵率分别为： 3 3 6 8 和1 3 4 1 。 关键词： 乳铁蛋 白； 盐析； 抗茵试验； 抑 菌率 乳铁蛋 白( 1 a c t o f e r r i n ， L F ) 是一种铁结合糖 蛋 白 质 ， 主要存在于哺乳动物的乳 、 眼泪 、 唾液 、 胆 汁等 分泌物中， 分子量约 8 0 0 0 0万。尤其在牛初乳 中含 量丰富， 约为 1 m g m L ， 比常乳高近 5 0 倍。研究发 现 ， L F是一种具有多种生物学功能的蛋白质 ，它不 仅参与铁的转运 ， 而且具有抗微生物 、 抗氧化、 抗癌 以及调节免疫系统等功能。 实验将母牛初乳通过硫酸铵沉淀 和 S e p h a d e x G 一 1 0 0葡聚糖凝胶过柱纯化 以及聚乙二醇浓缩提 取 了 L F ； 并利用它 的抗 微生物作用 ， 对猪源致病性 大肠埃希氏杆菌f E c o l i ) 和猪传 染性接触性胸膜肺 炎放线菌( A P P ) 进行 了抑菌试验。实验结果表明， L F 对 E c o l i 和 A P P的生长均有较明显的抑制作用 ， 现 报道如下 。 1 材 料与 方法 1 1 实验材料 1 1 1主要 试剂 。新鲜 母牛 初乳 ； ( N H ) ： S O 、 H C 1 、 N a O H、 聚 乙二醇 ( P E G 6 0 0 0 ) 、 S e p h a d e x G l o o ( 均为 国产分析纯试剂) ； p H试纸 、透析膜 U C 2 0 3 2 1 0 0 、 直径 0 2 2 m微孔滤膜 ( 均为进 口实验耗材 ) ； 普通 营养肉汤培养基、 P P L O琼脂培养基均按参考文献l1l 介绍 的方法配制。 1 1 2实验用菌种 。E 。 c o l i ， 编号 ： J X A V 0 7 0 3 ， 源 自江 西农业大学预防兽医学教研组分离保存 ； A P P ， 编号 C V C C 2 6 1 ， 源 自中国兽医药品监察所菌种室。 1 2 实验方 法 1 2 1牛初乳中乳铁蛋 白分离纯化 R 1 2 1 1饱和硫酸铵盐析沉淀 ， 参照文献 2 1方法 ， 稍有 改进 。取新鲜的牛初乳 ， 置于冰箱过夜 ， 再在室温下 3 0 0 0 r m i n离心 3 0 ra i n ， 去除表层乳脂 。 用 I O HC 1 调至 p H= 4 5 ， 置室温放置 3 0m i n ， 然后 4 8 0 0 0 r ra i n离心 3 0 ra i n 。去除沉淀物质( 除去酪蛋 白) 取上 清液( 酸乳清) ， 在磁力搅拌器下边滴加饱和硫酸铵 边搅拌 ，配成 5 0 饱和硫 酸铵溶液 ，室温沉淀 2 O mi n ， 然后 4 c 【 =8 0 0 0 r mi n离心 3 0 rai n 。再去除沉淀 ( 除去球蛋白)取上清液 ，用 1 0 N a O H调至 p H= 8 5 ，在磁力搅拌器下边滴加饱和硫 酸铵边搅拌， 配 成 8 0 饱和硫酸铵 ， 室温沉淀 2 0 rai n ， 再 4 c 【 =8 0 0 0 r m i n离心 3 0 ra i n ， 收集沉淀用双蒸水溶解得到乳铁 蛋 白粗提物 ， 置冰箱备用。 1 2 1 2 S e p h a d e x G一 1 0 0葡聚糖凝 胶过 柱层析及 浓 缩 ， 参照文献2 1方法 ， 稍有改进 。将层析柱用双蒸水 洗涤干净 ， 加预处理好的 S e p h a d e x G 一 1 0 0葡聚糖凝 胶装柱 ， 用蒸馏水平衡过夜 。 第 2 d ， 将饱和硫酸铵盐 析法分离的乳铁蛋白粗提物上样 ， 以 0 2m L mi n速 度双蒸水洗脱 ，用紫外分析仪检测其蛋 白的吸光 率 ，并通过便携式记录仪记 录其动态 的吸光率 曲 线 ， 同时用部分收集器收集各管洗脱液 。实验结束 时 ， 根据吸光率曲线将吸收峰各管合并得到乳铁蛋 白纯化样品 ， 置冰箱备用。 将乳铁蛋 白纯化样 品置预处理好 的透析膜 中， 扎 口置 4 0 的 P E G 6 0 0 0 溶液 中，浓缩至所需浓度 ， 置冰箱备用。 1 2 2 L F的抗菌试验 江西畜牧兽 医杂志 2 0 1 1 年第 1 期 实马 究 1 2 2 1菌液培养。E c o l i 、 A P P菌种分别接种于普通 肉汤培养基和 P P L O液体培养基中 ， 3 7 C 振荡培 养 1 6 h ， 使菌液达到一定浓度备用。 1 2 2 2 L F预处理 。 取分离纯化 L F ， 用针头式细菌滤 器经 0 2 2 p u m微孔滤膜除菌置冰箱备用 。 1 2 2 3 L F抗菌试验步骤。 取 4支无菌试管( 见表 1 ) ， 第 1支加入 5 mL普 通 肉汤+ 1 m L L F溶液+ 0 2 roL E c o l i 菌液 ； 第 2支加 入 5 mL普通 肉汤+ 1 m L无 菌生 理盐水 + 0 2m L E e o l i 菌液 。第 3支加入 5 m L P P L O液体培养基 + 1 m L L F溶液+ 0 2 m L A P P菌液 ； 第 4支加入 5 m L P P L O液体培养基 + 1 mL无菌生理盐水 + 0 2 m L A P P菌 液。混匀 ， 用无菌微量移液器分别取样 ， 在酶标仪 上 ，以各 自无菌培养基做对照调零 ，测量各 自的 0 D ，取样后迅速置 3 7 (2 振荡培养箱 中振荡培养 ， 并记录相应结果 。 每隔 2 h 取样一次， 重复上述试验， 检测 0 D ， 至第 8 h 结束， 并用红白细胞记数板计算各试管的细 菌总数 ， 算出 L F对 2种细菌的抑菌率 ， 记录结果。 抑菌率的计算公式如下 ： 押 菌率： ( t 小时后 对照组 茵数一 t 小时后 实验 组菌数) t 小 时后 对 照 组 菌数 X1 0 0 2 2 L F抗菌试验结果 L F抗菌试验结果见表 2 ， L F对 E c o l i 的抑菌效 果 ( 见图 2 ) ， L F对 A P P的抑 菌效果 ( 见 图 3 ) ， 其抑 菌率分别为 3 3 6 8 、 1 3 4 1 。 表 2 L F抗茵试验结果 试 验 分 组 8 h时细菌抑 茵 0 h 2 h 4 h 6 h 8 h 乓 个 m ) 率( ) b 0 01 8 0 0 8 5 0 1 3 4 0 2 06 o -23 5 20 2 1 0 3 3 68 脚 H 0 0 2 5 0 09 6 o 1 68 o 2 51 o 2 7 3 3-04 1 0 即0 0 21 Q01 7 Qo2 0 0 45 O _ o 7 6 2 37 1 0 1 3 41 L F抗 AP P 对 照 组0 0 3 1 0 0 3 6 0 0 5 3 0 0 7 6 0 1 0 3 2 7 3 x l 0 4 0 2 4 一 x一 添加L F 的E c o l 1 生长曲线 J廿空白对肫c 0 生长曲 表 1 抗菌试验分组 m L 图 2 L F对 E e o l i 的抑菌效果 2结果 2 1 牛初乳 中 L F分离结果 从牛初乳 中成功分离纯化 L F ，经过 S e p h a d e x G 一 1 0 0葡聚糖凝胶过柱的洗脱效果见图 1 。 图 1 L F粗提物 的 S e p h a d e x G 一 1 O 0 葡聚糖凝胶过柱的洗脱效果 0 2 4 6 8 一添加L F 的A P P 生长曲线【 t ( h ) 【- G-空白对照A P P 生长曲线 l 图 3 L F对 A P P的抑菌效果 3 小 结 与讨 论 3 1 本试验采用饱和硫酸铵盐析法成功地从新鲜 的牛初乳 中分离到乳铁蛋 白，经过 S e p h a d e x G 一 1 0 0 葡聚糖凝胶过柱层析纯化的乳铁蛋白经透析膜浓 缩后 ， 仍表现出较好 的抑菌效果 ， 对猪源致病性大 肠埃希 氏杆菌和猪传染性胸 膜肺 炎放线菌 的抑菌 率分别为 3 3 6 8 和 1 3 4 1 。 3 2 目前 国内对 L F的研究 已经不少 ，但其分离过 程均采用 了比较繁杂方法 ，对于工业化生产不利 。 本试验采用的饱 和硫酸铵盐析法 ，方法简便实用 。 9 江西畜牧兽 医杂 2 0 1 1 年第 1 期 实验研究 经过 2次 5 0 饱和度 、 8 0 饱和度硫酸铵沉淀后 ， 得 到 L F的粗提物。 再经过 S e p h a d e x G 一 1 0 0葡聚糖凝胶 过柱层析纯化样品，该方法是根据分子大小的不 同 进行分离， 设备简单 ， 操作方便 ， 不需要有机溶剂 ， 这 样在 分 离过 程 中不 容 易使 L F失 活 。最 后 采用 P E G 6 0 0 0浓缩法分离纯化 L F ， 该方法是利用蛋白分 子对半透膜的不可透 l生而使其与其他小分子分开的 方法 ，动力是扩散压 ，由横跨膜两边的浓度梯度形 成 ， 通常在 4 下进行 ， 设备简单 ， 操作方便 ， 不需要 有机溶剂， 这样在浓缩过程中不容易使 L F失活。最 终， 经抑菌试验证实 ， 分离所得 L F活性保持较好。 3 3 由图 2可见 ，在长达 8 h的 E c o l i 抑菌实验中， 添加 了 L F的 E c o l i 生长一直处于较缓但数量依然 增加的趋势 ， 而未添加 L F的对照管中 E c o l i 生长始 终保持较快的增长趋势 ， 这可能是在这 8 h内 E c o l i 的生长一直处在对数期 ， 而少量 L F对 E c o l i 较强的 抑菌作用，能在很长的时间内一直保持对 E c o l i 的 生长起减缓作用 ， 最后根据平板计数法也测得其抑 菌率为 3 3 6 8 ， 抑菌作用较强。 3 4 由图 3可见 ， 在 A P P抑菌实验中， 添加了 L F的 A P P在 0 2 h内生长呈下降趋 势 ，而未添加 L F的 A P P则呈缓慢 的增 长趋势 ，这可能是在这段 时问 A P P生长处在延迟期 ，因为 L F的抑菌作用导致其 生长呈下降趋势 ； 而在 2 8 h内 ， 添加了 L F的 P 生长则先呈较 慢的增长趋势后也逐渐转变成较快 的增长趋势 ，未添加 L F的 A P P则一直呈较快 的增 长趋势 ， 这可能是在这段时间内 A P P的生长处在对 数期 ， 少量 L F对 A P P的较弱抑菌作用 ， 无法阻止量 逐渐增多， 生长速度很快的 A P P数量的不断增长趋 势 ，但因 L F具有抑菌作用依然可 以在短时间内对 其生长速度起减缓作用。最后根据平板计数法也测 得其抑菌率为仅为 1 3 4 1 ， 抑菌作用较弱。 3 5 L F来源广泛 ， 如经过广泛和深入的研究 ， 实现 乳铁蛋 白的工业化生产 ， 牛初乳 中乳铁蛋白的开发 利用具有广阔的前景。 参考文献 ： 1 徐 逸 男， 汪 以真 乳铁 蛋 白研 究进展及 应用前景 J _ 饲料添 加剂 ， 2 0 0 6 ， 2 7 ( 8 ) ： 7 -